In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.
합성 물질은 혈관 대용으로 이식 때 염증, 협착, 감염 등의 임상 적 합병증을 시작하는 것으로 알려져있다. 콜라겐 인해 고유의 생체 적합성 광범위 생의학 광범위한 애플리케이션에 사용 된 합성 물질에 유효한 대안으로 간주된다 (즉, 낮은 항원 성, 염증 및 세포 독성 반응). 그러나, 제한된 기계적 특성 및 콜라겐 겔 관련된 낮은 핸드 능력은 혈관 조직 공학용 지지체 물질로서의 용도를 방해했다. 따라서, 본 작업 배후의 이론적 근거는 평활근 세포를 처리하기에 충분히 딱딱한 조직을 얻기 콜라겐 매트릭스 구동의 재구성을 개선하도록 관형 기하 형상 및 제 cellularized에 콜라겐 겔을 엔지니어 제였다.
여기에 설명 된 전략 차원 cyli 콜라겐 및 평활근 세포 (구성)의 직접 조립에 기초성형 기술의 사용과 ndrical 기하학. 이 프로세스는 1 또는 2 주 (외부인가 동적 기계적 제약없이) 구조는 정적 조건에서 생물 반응기에서 배양되는 동안 숙성 기간을 필요로한다. "정적 생물 반응기는"구조에 대한 모니터링하고 제어 무균 환경 (PH, 온도, 가스 교환, 영양 공급 및 폐기물 제거)를 제공합니다. 배양 기간 중, 두께 측정은 콜라겐 매트릭스의 셀 중심 리모델링을 평가하기 위해 수행하였으며, 글루코스 소비와 락트산 생산 속도는 세포 대사 활동을 모니터링하기 위해 측정 하였다. 마지막으로, 기계 및 점탄성 특성 결과 관상 구조에 대해 평가 하였다. 이 때문에, 특정 프로토콜과 집중 노하우 (조작, 등등, 그립 수화 된 환경에서 작업 등)에 엔지니어링 조직을 특성화하기 위해 개발되었다.
혈관 조직 공학 골격 합성, 세포 시트 기반 조직 공학적 혈관 (TEBVs), 및 세포 외 기질 (ECM)에 기초한 설계를 포함 이식편 혈관의 제조, 겨냥한 다른 전략 분계 TEBVs을 계획한다. 이러한 방법 중, 합성 고분자는 기계적 특성을 나타낸다, 그러나 생체 활성 1 부족으로 공통의 단점을 공유 할 수 있습니다. 세포 시트 기반의 방법은, 높은 기계적 특성과 설계 대체 혈관의 생성을 허용하지만, 이러한 그라프 트를 생산하기 위해 필요한 시간은 약 2 28주이다. 콜라겐, 엘라스틴, 섬유소 3 또는 이들의 조합으로 전자 재료의 천연 바이오 폴리머는, 이들의 조직 공학 발판을위한 황금 표준 물질을 남아있다. 이는 주로 기능성 세포 반응 4-5을 유도 할 수있는 동안이 물질은 일반적으로 좋은 생체 적합성을 가지고있는 이유입니다. 이러한 생체 고분자 중S, I 형 콜라겐은 피부 혈관 및 힘줄과 같은 많은 조직에서의 ECM의 가장 풍부하고 주된 하중 단백질 중 하나이다. 광범위한 작업 콜라겐 (6)의 기계적 특성에 실시 된 – 8하지만 정적 숙성 중에 콜라겐 겔 셀룰러 리모델링에서만 몇몇 연구가 있었다. 셀룰러 리모델링 콜라겐 원 섬유 네트워크 (9)의 안정성에 영향을 미칠 수있는 세포에 의해 유도 된 콜라겐 매트릭스의 구조적 변형을 말한다. 자연 발판으로, I 형 콜라겐의 비교적 큰 수량, 고립 된 멸균 쥐 꼬리 힘줄 (10)와 같은 다른 소스에서 저장 될 수있다. 콜라겐과 세포의 상호 작용과 cellularized 콜라겐 지지체 (구조)의 관련 전체 기계적인 행동을 이해하는 것은 조직의 건설을위한 필수적인 단계이다. 콜라겐 기반 TEBVs 직접 세포와 콜라겐을 혼합하여 처리 될 수있다젤 준비하는 동안 추가로 같은 관상 및 평면 (11)과 같은 특정 모양으로 성형. 젤 내부의 혈관 세포 증식 및 리모델링 유형은 내가 12 콜라겐. 따라서,이 방법은 조직 공학 응용을위한 골격의 발달에 중요한 문제 중 하나를 나타내는 특정 거대 다공성의 필요성을 우회. 그러나, 콜라겐 겔의 주요 단점은 낮은 기계적 성질은 합성 물질 (13)과 비교된다.
이 연구에서, 세포의 균일 한 분포를 가진 살아있는 조직은 하나의 단계 과정에서 세포와 콜라겐을 직접 혼합하여 설계 하였다. "정적 바이오 리액터"는 (외부인가 동적 기계적 제약없이) cellularized 콜라겐 겔의 정적 숙성 1 또는 2 주 동안 사용 하였다. 문화 동안, 콜라겐 매트릭스 리모델링 따라서 구조에 구조 보강을 제공 발생했습니다. 또한, 이러한 구조는 R 있었다eady는 회전 벽 생물 반응기로 전송하고 균일 한 내피는 달성되었다. 또한,이 연구에서 특정한 기계적 시험 프로토콜은 또한 관형 연조직의 기계적 성질을 특성화에 적합한 신규 한 접근 방식을 제공하기 위해 제안된다.
요약하면, 본 연구는 체외 신속한 제조 및 생물학적, 기계적 특성 분석 용뿐만 아니라, 결정적으로 간주되는 동적 생물 반응기에서 상기 기계적 조절에 대해뿐만 아니라 취급하기에 충분히 강한 혈관 조직의 성숙을위한 방법을 제시 조직의 재생에 단계.
혈관 조직 엔지니어의 사회 중에서 엄청난 노력이 혈관 (16)의 기계적 안정성을 담당 중막 층을 재현하기 위해 행해졌 다. 와인버그와 벨 (17)의 선구적인 작업 때문에, 콜라겐 널리 때문에 생체 적합성, 비 면역 원성 및 가용성의 혈관 조직 공학을위한 발판으로 사용되어왔다. 이 물질 때문에 기계적 강성 극한 부족하여 취급이 용이하지 않다하지만, 콜라겐의 사용은 연구자 큰 도전을 나타낸다. 비계 준비하는 동안 조작은 더 사용할 수 있도록 손상, 비계가 손상 될 수 있습니다.
이 연구에서 기술 된 기법은 허용 : i)는 관형 형상의 형상으로 cellularized 콜라겐 겔을 설계하는 단계; ⅱ) 짧은 정적 숙성 기간 (1 ~ 2 주) 후 처리 할 수있을만큼 강한 생체 조직을 설계하는 단계; III)로서 행2 방향 등 관 모양의 생물 조직의 SESS 기계 및 점탄성. 겔에있는 세포는 콜라겐 매트릭스 리모델링에서 중요한 역할을한다. 숙성 기간 동안 수축 SMCs는 종 방향 및 원주 방향으로 평가 될 수있는 높은 기계적 안정성과 구조체를 수득 겔의 압축되었다. 구조 따라서 혈관 조직 공학 응용 프로그램에 대한 콜라겐 젤의 적합성을 입증, 균일하고 가능한 내피 세포 생성의 이후, HUVECs를가 내강 측에 시드.
이 연구에서 제시된 생물 반응기는 특히 정전기 성숙 동안 세포 성장을위한 최적의 환경을 제공하도록 설계되었다. 또한, 구조물의 기계적 및 점탄성 특성의 특성화를 위해 개발 된 장치의 조작에 고유 한 잠재적 인 손상을 감소시키기위한 목적으로 설계되었다이러한 섬세한 재료. 따라서, 정적 인 생물 반응기 뚜껑에 0.22 ㎛의 필터 및 필터 멤브레인 (단계 1.1.2,도 1A의 장착 하였다 및 B) 배양 무균 환경을 유지하면서, 저장조 및 배양기 안에 배양액 사이에서 가스 교환을 사용할 것이다. 하단 루어 격벽은 배양 배지 샘플링 포트로서 이용하고 정적 배양 동안 변화한다. 일부 중요한 단계는 구조의 제조 및 특성 분석에서 고려되어야한다. 무균 시스템을 변경할 수있다 (후속 단계 및 단계 2.1.1에서 수행됨) 모든 조작은 무균 생물학적 후드에서 수행 하였다. 세포를 콜라겐 겔 혼합물 제제 겔화 과정을 지연시키기 위해 얼음에 처리 하였다 (2.1.7 2.1.4 단계). 단계 2.1.7에서, 종래 겔화 혼합물에 갇힌 어떤 공기 기포는 S를 손상시킬 잠재 응력 집중 영역은구조의 tability. 따라서, 공기 거품의 제거는 약간 어셈블리를 흔들어 또는 멸균 조건에서 탈 가스에 대한 3 분 동안 의료 진공을 사용하여 필요합니다. 마지막으로, 그립은 특히 겔화 동안 관 금형 중앙 맨드릴의 축 유지 및 내피 세포 형성을 위해, (맨드릴의 제거, 2.4 절)을 수확하는 동안 구조의 섬세한 조작이 가능하도록 설계 및 촉진에 장착 된 기계 시스템 (종 시험).
본 프로토콜은 SMCs의 자연 고유의 수축 가능성을 기반으로 콜라겐 젤 구조의 강화의 원래 쉬운 과정 대체 방법을 제안한다. 20 – 콜라겐 매트릭스 보강재의 일반적인 기술은 세포 – 매트릭스 상호 작용 (18)에 해로운 영향을 미칠 수있는 물리적, 화학적 가교제의 사용을 포함한다. 제시 제조 기술이 작품은 물리적 또는 화학적 처리없이 대상 기계적 특성을 가진 조직 공학적 구조를 얻을이 세포 중심의 리모델링 과정을 지시하는 허용한다.
수화 콜라겐 젤의 기계 및 점탄성의 특성은 큰 도전이다. 이러한 관점에서, 본 프로토콜은 관형 연조직의 기계적 성질을 평가하기위한 원래의 간단하고 효율적인 방법을 설명한다. 이 특성은 직접 전체 관형 구조체에 원주 방향뿐만 아니라 길이 방향으로뿐만 아니라 수행 할 수있다. 기계적 특성, 온도, 수성 환경, pH 및 이온 강도 동안 격렬 생체 조직 (21)의 기계적 동작에 영향을 미치는 것으로 알려진 환경 요소의 일부이다. 따라서, 본 연구는 매우 생물 조직의 기계적 특성에 대한 원래의 설정과 프로토콜을 제안한다재현성 의사 생리적 환경 (37 ° C 및 pH 7.4의 생리 식염수 용액). 우리가 아는 한, 특성의이 종류는 다른 곳에서보고 된 적이있다.
결론적으로,이 연구에서 제안 된 기술은 혈관 조직 공학 응용을위한 콜라겐 세포의 직접적인 믹싱의 높은 잠재 성을 보여준다. 기계적 특성 및 프로세스에 내피 세포와 함께이 방법은 높은 다가 프로토콜을 구성한다. 따라서, 셋업과 같은 원리를 유지하면서 프로토콜의 약간의 수정을 통해, 엔지니어링 혈관 조직 당량위한 주요 요구는 신속하고 단순한에 내피를 포함하여 처리하고, 가능성 등 해결할 수는 연질의 광범위한 행열 다양한 길이와 직경 어떤 조직이. 또한, 부착 세포 유형, ECM 단백질 성형 형상 다른 타겟이 입학 원서의 수를 조사 할 수있다같은 다른 사람의 사이에서 엔지니어링 힘줄, 피부 이식, 심장 패치, 신경 등의 기능. 구조물의 기계적 성질 고무적이지만, 이들은 기본 조직에 비해 여전히 낮다. 이러한 맥락에서, 우리는 강하게 매우 짧은 정적 성숙 기간이 이렇게 높은 구조적 무결성 및 기계적 안정성을 선도, 생물 반응기에 동적 자극을 향한 중요한 단계라고 생각합니다. 그러나, 가능성은 급격히 기계적 적합한 조직 공학적 cellularized 콜라겐 기반 구조를 제조하고, 조직 학적 성장 및 리모델링, 또는 행 동안 세포와 ECM 사이의 상호 작용에 대한 통찰력을 제공하기 위해 유용하고 유망한 도구는 본원에 기재된 정적 생물 반응기하게 분석 치료 및 약물 전달 시스템을위한 모델로서 이용 될 수있다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 자연 과학 및 캐나다의 공학 연구 협의회, 건강 연구의 캐나다 연구소 CHU 드 퀘벡 연구 센터에 의해 투자되었다.
CellTreat 50 mL Bio-Reaction tubes | CELLTREAT Scientific Products | 229-475 | Centrifuge tube |
Male luer with lock ring x 1/8" hose barb. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45503-04 | Luer fittings for "gas-exchange port" |
Female luer x 1/8" hose barb adapter. PP. 25/pk | Cole Parmer | RK-45500-04 | Luer fittings for the "medium sampling port" |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 17. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-17 | Tube 1 and 2 for the gauze grippers |
Masterflex platinum-cured silicone tubing L/S 16. 25 ft. | Cole Parmer | RK-96410-16 | Tube 3 for the gauze grippers |
Silastic Medical adhesive silicone, type A | Dow Corning | – | Silicon glue for the fabrication of the static bioreactor |
Polyvent 4 Vessel venting filters | Whatman | 6713-0425 | Filter for "gas exchange port" |
Rod. PP. stirring. 8’’ | Scienceware | 377660008 | Mandrel |
Stopper silicone rubber 00 PK12 | VWR | 59590-084 | Stopper for the insertion of the mandrel to the vented cap of the centrifuge tube |
Krytox PFPE/PTFE Greases | Dupont | GPL 202 | Medical grade grease for covering the mandrel |
Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 | Cell culture |
Xiameter RTV-4130-J base and curing agent | Dow Corning | – | C-shaped silicone support for endothelialization |
Dulbecco’s modified Eagle medium, DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco (Life Technology) | 11995-065 | Cell culture |
Pure acetone (99%) | Laboratoire Mat Inc. | AP0102 | Chemical for collagen extraction |
Isopropyl alcohol (HPLC grade, 99.9%) | Fisher Scientific | AC610080040 | Chemical for collagen extraction |
0.02 N acetic acid (glacial acetic acid, HPLC grade, 99%; Fisher Scientific, | Fisher Scientific | FL070494 | Chemical for collagen extraction |
Chloroform solution (99%) | Laboratoire Mat Inc. | CR 0179 | Chemical for collagen extraction |
Hepes | Sigma-Aldrich | 163716 | Chemical for construct preparation |
NaOH | Laboratoire Mat Inc. | SR-0169 | Chemical for construct preparation |
LaserMike 136 | LaserMike | Series 183B | Scanning laser interferometer |
ElectroPulse MicroTester | Instron Corporation | – | Micromechanical Tester |
HyClone Media M199/EBSS, 500 mL | GE Healthcare Life Sciences | SH30253.01 | Component of cell culture medium |
Fetal bovine serum HI – 500mL | Gibco | SH 30396.03 | Component of cell culture medium |
Porcine serum (PS) | Sigma-Aldrich | P9783 | Component of cell culture medium |
Penicillin-Streptomicin | Gibco | 15140-122 | Component of cell culture medium |
Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | BP661-50 | Saline solution |
Tissue culture flask T17CN Vent Cap Red | Sarstedt Inc. | 83.1812.002 | Cell culture |
ColorpHast- pH-indicator strips (pH=6.5-10.0) | EMD | 9583 | pH measurements |
Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, 5 mL vial | BD Biosciences – Discovery Labware | 356230 | Concentrate protein mixture for endothelialization process |
LifeCam VX-3000 | Microsoft | – | Thickness measurement |
Biochemical analyzer, DxC600 | Beckman Coulter Unicell Synchron | – | Glucose and lactate concentrations measurements |
Collagen fibers | Rat tails | – | Collagen was extracted in the laboratory |
Porcine smooth muscle cells (pSMCs) | Porcine aortas | – | pSMCs were isolated in the laboratory |
Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | Human umbilical veins | – | HUVECs were isolated in the laboratory |