تتبع التغييرات الناجمة عن المخدرات في مستقبلات بعد استيعاب الاتجار عن طريق تحليل Colocalizational
Summary
الاتجار مستقبلات الإشارات وينظم الخلايا على الاستجابة للجين وهو، في حد ذاته، استجابة لظروف الخلية، بما في ذلك الناجم عن يجند الإشارات. هنا، نحن تصف تقنية قوية ومرنة لتقييم كمي الاتجار مستقبلات المخدرات التي يسببها استخدام immunolabeling وتحليل colocalizational.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
المستقبلات، خصوصا G البروتين إلى جانب مستقبلات (GPCRs)، يتم تهريب روتينية داخل الخلية، من وإلى سطح الخلية 1. هذه العمليات المدبرة التعقيد وتفرض رقابة مشددة يكمل مستقبلات المتاحة الخلايا وتنظيم النشاط مستقبلات الزمني، الحساسية، وresensitization 2-4. الأهم من ذلك، هذه العمليات التي تستجيب لبيئات الخلوية بما في ذلك نشاط مستقبلات المخدرات التي يسببها أو الخمول. وهذا هو، لا يمكن للأعمال بروابط في مستقبلات يغير الاتجار داخل الخلايا من تلك المستقبلات، وبالتالي تغيير استجابة الخلية. على هذا النحو، تمارس بروابط خارجية حتى الآن أكثر الآثار على وظيفة الخلية، وحتى أبعد الكلاسيكية رسول إلى المستجيب شلالات 5،6.
دراسة مثل هذه التغييرات في الاتجار مستقبلات يسببها أمر صعب. تتضمن كل التقنيات المتاحة القيود. وقد استخدمت المقايسات حماية البيوتين إلى مونيتور مستقبلات سطح السكان. والبيروكسيديز هذه المستقبلات ويتم تنفيذ timecourse من immunoprecipitations لقياس انخفاض مستقبلات المعقدة البيروكسيديز مع مرور الوقت. هذه التقنية ترصد أساسا تدهور تدريجي من الأولي، وصفت والسكان مستقبلات 7، ومفيد جدا في بناء دورات الزمني لهذه العملية. للأسف، هذا الاختبار غير قادر على رصد أي عملية أخرى من تدهور تجمع الأصلي من المستقبلات، مثل استيعاب وإعادة التدوير، أو مستقبلات جديدة. أيضا، إضافة إلى الأجسام المضادة في نطاق 150kDa إلى مستقبلات في نطاق 50kDa يمكن أن يغير الاتجار مستقبلات في 8،9، ويمكن أن يكون من الصعب استخدام مع مستقبلات منخفضة على مستوى التعبير هذه التقنية.
استخدام الإجراءات غيرها من وسائل مختلفة لتحديد الأجزاء الاتجار داخل الخلايا (على سبيل المثال، الإندوسومات، الخ)، وتقييم colocalization مع مستقبلات الفائدة. وهذا يشمل الولايات المتحدة(ه) من أنظمة مغاير معربا عن الفلورسنت البروتين الموسومة يبني خيالية من المستقبلات وعلامات مقصورة (GTPases على سبيل المثال، رب الأسرة). هذا يحتمل أن يتيح استخدام التصوير الخلية الحية، وإزالة القضايا المتعلقة تثبيت وpermeabilization. في حين قوية، تعاني هذه الاستراتيجية من نفس القيود المفروضة على أنظمة مغاير بشكل عام: العلامة ومستوى التعبير الآثار المترتبة على الاتجار السلوك وعدم التوافق مع أنواع الخلايا أكثر تمثيلا من الناحية الفسيولوجية. أكثر شعبيا، وتستخدم الأصباغ لتسمية بسهولة حجرات داخل الخلايا (مثل الجسيمات الحالة، ظاهريا) 10. الأصباغ، ومع ذلك، يمكن تفتقر إلى الدقة (جميع العضيات الحمضية في حالة من الأصباغ لالجسيمات الحالة) وليس لتقييم الاتجار بالبشر من خلال المقصورات الأخرى. ومع ذلك، هذه التقنيات تتيح سيطرة كبيرة على النظام والظروف التجريبية، ويمكن الاستفادة من طرق التحليل colocalization المقدمة هنا أدناه.
طريقة ثالبريد الحاضرين هنا تهذب تتبع الاتجار مستقبلات التي كتبها colocalization. باستخدام مناعية (ICC) لتسمية علامات المناسبة، فمن الممكن تحديد عدة حجرات داخل الخلايا متميزة. هذا أيضا يسمح باستخدام زراعة الخلايا الأولية من الناحية الفسيولوجية ذات الصلة في مكان نظم مغاير. ويشمل هذا البروتوكول ICC تحديد خلايا الفائدة قبل وضع العلامات. هذا يسمح وضع العلامات في timepoint المحددة التالية العلاج من تعاطي المخدرات (ق). وهذا ينتج عنه 'لقطة' من الجمعيات مستقبلات مقصورة العالمية في ذلك timepoint. مع timepoints متعددة، timecourse التغيرات الاتجار يمكن أيضا أن يتم بناؤها.
لفترة وجيزة، والخلايا هي المخدرات المعالجة، وصفت لمستقبلات وحجرة داخل الخلايا من الفائدة، تصوير confocally، ويتم تحليل photomicrographs لتحديد رياضيا colocalization من مستقبلات والمقصورة 11. في استخدامنا، درسنا colocalization من مستقبلات مع رعB5، Rab11، والليزوزومية المرتبطة بروتين الغشاء 1 (LAMP1). هذه علامات تحديد الإندوسومات في وقت مبكر، الإندوسومات إعادة التدوير، والجسيمات الحالة، على التوالي. تعمل هذه التدابير colocalization كوكلاء للعمليات الشاملة للاستيعاب، وإعادة التدوير، وتدهور 12.
كما هو الحال مع جميع التقنيات، وينبغي النظر في بعض القيود. نظرا للحاجة إلى صورة حللت كل الخلايا العصبية الفردية، ويمكن هذا الأسلوب أصبح جدا كثيفة العمالة وفقا لعدد من الشروط وtimepoints المعنية. يجب على جميع immunolabeling أيضا يتعامل مع الآثار المترتبة على التركيب الدقيق الخلوية، وبروتين التعريب، وحاتمة الوصول الناجمة عن التثبيت وpermeabilization 13.
على الرغم الأمثل أصلا للاستخدام مع الثقافات الأولية من الخلايا العصبية الحسية الأولية، وهذا الأسلوب هو متوافق على نطاق واسع مع غيرها من نماذج الثقافة مطلي أحادي الطبقة.
استخدام قياس آثافة كميا رياضيا(ه) من colocalization هو، ولا سيما، أكثر بكثير منهجيا دقيقا من التقنيات السابقة المستخدمة لتقييم التغيرات الاتجار مستقبلات، والتي غالبا ما تعتمد على وتدابير غامضة غير موضوعية مثل تفقد البصر تراكب متعدد القنوات (14).
هذه التقنية مفيدة بشكل خاص للتوافق واسع مع التدخلات في الجسم الحي (قبل جيل ثقافة الأساسي)، في المختبر التدخلات (خلال نمو ثقافة)، ومختلف العلامات تستهدف 15. على هذا النحو، فإنه يمكن تكييفها للعديد من الأسئلة البحثية المختلفة.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد الأمثل هذا البروتوكول لتحليل الثقافات الأولية من الكبار الخلايا العصبية عقدة الجذر الظهري (الخلايا العصبية الحسية الأولية). ويمكن أيضا أن تستخدم، مع تعديل طفيف أو لا، لالخلايا المستزرعة مطلي أحادي الطبقة على نطاق واسع. تحليل colocalizational من الممكن أيضا في شرائح الأ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من خلال منحة من CIHR (MOP394808) وكرسي أبحاث كندا لCMCEWO كان المستفيد من منحة الدراسات العليا من NSERC.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. . Discovering Statistics Using R. , (2012).
- Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- Johnson, I., Spence, M. . The Molecular Probes Handbook. , (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
