Tracking-Drug-induzierte Veränderungen der Post-Rezeptor-Internalisierung Handel durch Colocalizational Analysis
Summary
Rezeptor-moduliert Signalisierung und Zellen gegenüber Liganden und ist selbst in Reaktion auf Zellbedingungen, einschließlich Liganden-induzierte Signalisierung. Hier beschreiben wir eine leistungsfähige und flexible Methode zur quantitativen Beurteilung der Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Verwendung von Immunmarkierung und colocalizational Analyse.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
Rezeptoren, insbesondere G-Protein gekoppelte Rezeptoren (GPCRs), werden routine intrazellulär gehandelt, zu und von der Zelloberfläche 1. Diese aufwändig orchestrierte und streng kontrollierte Prozesse diktieren verfügbar Rezeptor Ergänzungen Zellen und regulieren Rezeptor zeitliche Aktivität, Desensibilisierung und Resensibilisierung 2-4. Wichtig ist, dass diese Verfahren, die auf zelluläre Umgebungen, einschließlich Arzneimittel-induzierte Rezeptor-Aktivität oder Inaktivität. Das heißt, die Aktionen der Liganden an Rezeptoren intrazellulären Transport von diesen Rezeptoren verändern, wodurch Zellreaktionsfähigkeit zu verändern. Auf diese Weise üben externe Liganden noch weitere Auswirkungen auf die Zellfunktion, auch jenseits der klassischen Messenger-zu-Effektor-Kaskaden 5,6.
Prüfung solcher Änderungen induzierte Rezeptor-ist schwierig. Alle verfügbaren Techniken beinhalten Einschränkungen. Biotin-Schutzassays wurden benutzt, um monitor Oberflächenrezeptoren Populationen. Diese Rezeptoren werden biotinyliert und einen Zeitverlauf von Immunpräzipitationen durchgeführt, um die Verringerung der biotinylierte Rezeptoren über die Zeit quantifiziert. Diese Technik überwacht im Wesentlichen den allmählichen Abbau von einer anfänglichen, beschriftet, Bevölkerung von Rezeptoren 7 und ist sehr nützlich bei der Konstruktion von Zeitkurse dieses Prozesses. Leider ist dieser Test nicht imstande, jede andere als Verschlechterung des ursprünglichen Pool von Rezeptoren, wie die Internalisierung, Recycling oder neue Rezeptoren zu überwachen. Auch kann die Zugabe eines Antikörpers in dem 150kDa Bereich auf einen Rezeptor in der 50kDa Bereich des Rezeptors Handel 8,9 verändern, und diese Technik kann nur schwer mit niedrigen Expressionsebene Rezeptoren verwenden.
Andere Verfahren verwenden verschiedene Methoden, um intrazellulären Transport Fächer (zB Endosomen, etc.) identifizieren und bewerten ihre Kolokalisation mit den Rezeptoren von Interesse. Dies beinhaltet die unse von heterologen Systemen zum Ausdruck Fluoreszenzprotein-markierten chimären Konstrukten der Rezeptoren und Fach-Marker (zB Rab-GTPasen). Dies ermöglicht potentiell die Verwendung von Live-Cell-Imaging, das Entfernen Fragen Fixierung und Permeabilisierung zusammen. Während mächtig, leidet eine solche Strategie aus den gleichen Einschränkungen der heterologen Systemen im Allgemeinen: tag und Expressionsniveau Auswirkungen auf den Menschenhandel Verhalten und Unvereinbarkeit mit mehreren physiologisch repräsentativen Zelltypen. Besser bekannt werden Farbstoffe verwendet werden, um leicht zu beschriften intrazellulären Kompartimenten (zB Lysosomen, angeblich) 10. Farbstoffe, können jedoch die Spezifität (alle sauren Organellen im Falle von Farbstoffen für die Lysosomen) fehlt und nicht Handels durch andere Kompartimente beurteilen. Dennoch, diese Techniken ermöglichen erhebliche Kontrolle über das System und die experimentellen Bedingungen und können von den Kolokalisationsanalyse hier vorgestellten Methoden, unten zu profitieren.
Das Verfahren whier anwesend e verfeinert die Verfolgung von Rezeptor-durch Kolokalisation. Verwendung Immuncytochemie (ICC) auf geeignete Marker kennzeichnen, ist es möglich, mehrere unterschiedliche intrazelluläre Kompartimente zu identifizieren. Dies ermöglicht auch die Verwendung von physiologisch relevanten primären Zellkulturen anstelle von heterologen Systemen. Das ICC-Protokoll beinhaltet die Festsetzung der Zellen von Interesse vor der Markierung; dies ermöglicht die Kennzeichnung bei einem bestimmten Zeitpunkt nach der Arzneimittelbehandlung (en). Dies erzeugt eine "Momentaufnahme" der globalen Rezeptor-Kammer-Verbände zu diesem Zeitpunkt. Mit mehreren Zeitpunkten kann ein Zeitverlauf des Menschenhandels Änderungen auch gebaut werden.
Kurz gesagt, Zellen werden mit Arzneimittel behandelten, für den Rezeptor und intrazellulären Kompartiment von Interesse markiert konfokal abgebildet wird und die Mikrophotographien, werden analysiert, um mathematisch quantifizieren Kolokalisation des Rezeptors und das Fach 11. In unserer Anwendung, die Co-Lokalisierung eines Rezeptors mit Ra untersuchten wirb5, Rab11 und Lysosomale-associated membrane protein 1 (LAMP1). Diese Marker identifizieren frühe Endosomen, Recycling Endosomen und Lysosomen sind. Diese Kolokalisation Maßnahmen wirken als Proxies für die übergreifenden Prozesse der Verinnerlichung, Recycling und Abbau 12.
Wie bei allen Techniken sollen einige Einschränkungen berücksichtigt werden. Aufgrund der Notwendigkeit, jede einzelne Bild Neuron analysiert, kann dieses Verfahren ziemlich arbeitsintensiv werden abhängig von der Anzahl von Bedingungen und Zeitpunkte einbezogen. Alle Immunomarkierung muss auch mit den Auswirkungen auf die zelluläre Ultrastruktur, Protein-Lokalisierung und Epitop Erreichbarkeit mit Fixierung und Permeabilisierung 13 verursacht kämpfen.
Obwohl ursprünglich für die Verwendung mit primären Kulturen von primären sensorischen Neuronen optimiert ist dieses Verfahren weitgehend mit anderen Monoschicht überzogenen Kulturmodellen.
Die Verwendung eines mathematisch quantifiziert measure der Kolokalisation ist, vor allem, viel mehr methodisch rigorosen als bisherige Techniken verwendet werden, um Rezeptor-Änderungen, die oft auf vage, subjektive Maßnahmen wie visuell inspiziert Multi-Channel-Überlagerungen 14 verlassen haben, zu beurteilen.
Diese Technik ist besonders nützlich für ihre gute Verträglichkeit mit den in-vivo-Interventionen (vor der Primärkultur Generation), In-vitro-Interventionen (während der Kulturwachstum) und verschiedene Kennzeichnungs zielt 15. Als solches kann es viele verschiedene Forschungsfragen angepasst werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Wir haben dieses Protokoll für die Analyse der Primärkulturen adulter Dorsalwurzelganglionneuronen (primäre sensorische Neuronen) optimiert. Es kann auch verwendet werden, mit geringer oder keiner Modifikation, zum Monobeschichtete kultivierten Zellen breit. Die colocalizational Analyse ist auch möglich, in Gewebeschnitten und anderen solchen Zubereitungen 11, aber die Drogentherapie und Gewebefixierung / der Zubereitung Komponenten nicht angemessen wäre.
Von Interesse ist, k…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von CIHR (MOP394808) und Canada Research Chair zu CMCEWO getragen war der Empfänger eines Post-Graduate Scholarship von NSERC.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
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