Colocalizational Analizi Reseptör Sonrası içselleştirme Ticareti Uyuşturucu kaynaklı Değişiklikleri İzleme
Summary
Reseptör ticareti ligandlarına sinyal ve hücre yanıt modüle ve kendisi ligand bağlı sinyal dahil olmak üzere hücre koşulları, yanıt verici olmaktadır. Burada, biz kantitatif immün ve colocalizational analizi kullanılarak ilaca bağlı reseptör ticaretini değerlendirmek için güçlü ve esnek bir teknik açıklar.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
Reseptörler, özellikle de G protein bağlı reseptörler (GPCR'ler), rutin ve hücre yüzeyi 1, hücre içi kaçırılan. Bunlar karmaşık bir orkestra ve sıkı kontrol süreçleri hücrelerin mevcut reseptör tamamlar dikte ve reseptör zamansal aktivite, duyarsızlaştırma ve resensitization 2 düzenleyen – 4. Önemli olarak, bu işlemler, ilaca bağlı reseptör aktivitesi veya işlem de dahil olmak üzere, hücresel ortama duyarlı. Diğer bir deyişle, reseptörlerindeki ligandlannın etkimeleri ve böylece hücre yanıt değiştirmeden, bu reseptörlerin hücre içi değiştirebilir. Bu şekilde, bu dış ligandlar da klasik haberciye-to-efektör kaskadları 5,6 ötesinde, daha fazla etkiler, hücre fonksiyonu üzerinde yapılmamış gösterirler.
Uyarılmış reseptör kaçakçılığı gibi değişiklikler incelenmesi zordur. Mevcut tüm teknikler sınırlamaları içerir. Biyotin koruma deneyleri moni için kullanılmıştırtor yüzeyi reseptörleri popülasyonları. Bu reseptörler, biyotinile edilmiş ve İmmüno bir timecourse zamanla biyotinile reseptörleri azalmayı ölçmek için gerçekleştirilir. Bu teknik, esas olarak reseptör 7 arasında bir başlangıç, etiketlenmiş, popülasyonda bozunmasını takip eder ve bu işlem zaman içerisinde inşa çok yararlıdır. Ne yazık ki, bu deney gibi içselleştirilmesi, geri dönüşüm, ya da yeni reseptörler olarak reseptörlerin, orijinal havuzun bozulması dışında herhangi bir işlem izlemek için değiştiremiyor. Ayrıca, 50kDa aralığında bir reseptöre 150kDa aralığında bir antikorunun ilavesi reseptörün kaçakçılığı 8,9 değiştirebilir ve bu teknik, düşük ekspresyon düzeyi reseptörleri ile kullanmak için zor olabilir.
Diğer işlemler hücre içi ticareti bölmeleri (örneğin, endozomlar, vs.) belirlemek ve ilgi reseptörleri ile ko değerlendirmek için çeşitli yöntemler kullanırlar. Bu bizi içeririfade heterolog sistemlerde e reseptörleri ve bölme belirteçleri (örneğin, Rab-aile GTPases) kimerik yapıları floresan proteini etiketli. Bu potansiyel fiksasyon ve permeabilization ile ilgili konuları kaldırarak, canlı hücre görüntüleme kullanımını sağlar. Daha fizyolojik temsilci hücre tipleri ile davranış ve uyumsuzluk ticareti üzerindeki etiketi ve ifade seviyesi etkileri: Güçlü iken, böyle bir strateji heterolog genel sistemlerin aynı sınırlamalara muzdarip. Daha halk, boyalar kolaylıkla hücre içi bölmeleri etiketlemek için kullanılır (örneğin, lizozomlar, görünürde) 10. Boyalar, ancak özgüllüğü (lizozomlar için boyalar durumunda bütün asidik organeller) eksikliği ve diğer bölmeleri sayesinde ticaretini değerlendirmek yok. Yine de, bu teknikler, sistem ve deneysel koşullar üzerinde önemli bir kontrole olanak aşağıdaki burada sunulan ko analiz yöntemleri yararlanabilir.
Metot WBurada mevcut e ko reseptör ticareti izleme geliştirir. Uygun belirteçleri etiket immünsitokimya (ICC) kullanarak, birden fazla farklı hücre içi bölmeleri tespit etmek mümkündür. Bu, aynı zamanda, heterolog sistemlerde yerine fizyolojik olarak-ilgili primer hücre kültürlerinde kullanımına izin verir. Bu ICC protokol etiketleme öncesi ilgi hücreleri tespit kapsar; Bu ilaç tedavisi (ler) itibaren belirli bir timepoint etiketleme izin verir. Bu, o zaman noktasında küresel reseptör bölmesi dernekleri bir 'anlık' üretiyor. Birden timepoints ile kaçakçılık değişikliklerin bir timecourse da inşa edilebilir.
Kısaca, hücreler, ilaç ile muamele edilmiş, reseptör ve ilgi duyulan hücre içi bölüm için etiketli, odaksal olarak görüntülü ve fotomikrografları matematiksel reseptör ve bölme 11 arasında ko ölçmek için analiz edilir. Bizim kullanımı, biz Ra ile bir reseptörün ko incelendiğindeb5, Rab11 ve membran protein 1 (LAMP1) Lizozomal ilişkili. Bu belirteçler, sırasıyla erken endozomlar, geri dönüşüm endozomlar ve lizozomları belirlemek. Bu ko önlemler içselleştirilmesi, geri dönüşüm ve yıkımı 12 kapsayıcı süreçler için vekiller olarak hareket ederler.
Tüm teknikler ile olduğu gibi, bazı sınırlamalar dikkate alınmalıdır. Nedeniyle her bireyin nöron analiz görüntüye ihtiyacı, bu tekniğin ilgili koşullar ve timepoints sayısına bağlı olarak oldukça emek-yoğun hale gelebilir. Tüm immün da fiksasyon ve permeabilization 13 neden hücresel ultrastrüktürün, protein lokalizasyonu ve epitop erişilebilirlik üzerindeki etkileri ile uğraşmak gerekir.
Başlangıçta birincil duyu nöronlarının birincil kültürlerinde kullanılmak için optimize edilmiş olsa da, bu yöntem diğer tek tabaka kaplama kültürü modelleri genel olarak uyumludur.
Bir matematiksel sayısal MEASUR kullanımıko e özellikle, çok daha metodolojik, genellikle bu tür görsel-kontrol çok kanallı bindirmeleri 14 olarak belirsiz, öznel ölçütlere yararlanmıştır reseptör kaçakçılığı değişiklikleri değerlendirmek için kullanılan önceki tekniklere göre daha titiz olduğunu.
Bu teknik, in vivo girişimler (önce primer kültür üretimi) ile geniş uyumluluk için özellikle yararlıdır, in vitro müdahaleler (kültür büyüme sırasında) ve çeşitli etiketleme 15 hedefler. Bu nedenle, çok sayıda farklı araştırma sorulara uyarlanabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Erişkin dorsal kök ganglion nöronlarının (birincil duyu nöronları) birincil kültürleri analizi için bu protokolü optimize ettik. Aynı zamanda, genel olarak tek tabaka kaplama kültürlenmiş hücreler için, az ya da hiç bir değişiklik, kullanılabilir. colocalizational analiz ancak ilaç tedavisi ve doku tespit / hazırlık bileşenleri uygun olmaz, aynı zamanda doku dilimleri ve benzeri hazırlıkları 11 mümkündür.
Ilgi çekici olan, burada sunulan ICC yönte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser CIHR (MOP394808) ve CMCEWO bir Kanada Araştırma Başkanı bir hibe ile desteklenen NSERC bir Post-Yüksek Lisans Bursu layık görüldü.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. . Discovering Statistics Using R. , (2012).
- Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- Johnson, I., Spence, M. . The Molecular Probes Handbook. , (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
