Sporing Drug-induced Endringer i Receptor Post-intern Trafficking etter Colocalizational Analysis
Summary
Receptor trafficking modulerer signalering og cellenes respons på ligander og er, i seg selv, som reagerer på celle forhold, blant annet ligandindusert signalering. Her beskriver vi en kraftig og fleksibel teknikk for kvantitativt vurdere legemiddelindusert reseptor trafficking ved hjelp immunolabeling og colocalizational analyse.
Abstract
The intracellular trafficking of receptors is a collection of complex and highly controlled processes. Receptor trafficking modulates signaling and overall cell responsiveness to ligands and is, itself, influenced by intra- and extracellular conditions, including ligand-induced signaling. Optimized for use with monolayer-plated cultured cells, but extendable to free-floating tissue slices, this protocol uses immunolabelling and colocalizational analysis to track changes in intracellular receptor trafficking following both chronic/prolonged and acute interventions, including exogenous drug treatment. After drug treatment, cells are double-immunolabelled for the receptor and for markers for the intracellular compartments of interest. Sequential confocal microscopy is then used to capture two-channel photomicrographs of individual cells, which are subjected to computerized colocalizational analysis to yield quantitative colocalization scores. These scores are normalized to permit pooling of independent replicates prior to statistical analysis. Representative photomicrographs may also be processed to generate illustrative figures. Here, we describe a powerful and flexible technique for quantitatively assessing induced receptor trafficking.
Introduction
Reseptorer, spesielt G-protein koblede reseptorer (GPCR), blir rutinemessig trafikkert intracellulært, til og fra celleoverflaten 1. Disse complexly orkestrert og tett kontrollert prosesser diktere cellenes tilgjengelige reseptor utfyller og regulere reseptor tidsmessig aktivitet, desensitivisering, og resensibilisering 2 – 4. Viktigere, disse prosessene er lydhør overfor cellulære miljøer, inkludert legemiddelindusert reseptor aktivitet eller inaktivitet. Som er, kan handlingene til ligander på reseptorer endre intracellulær trafficking av disse reseptorene, og dermed endre cellerespons. På denne måte eksterne ligander utøve enda flere effekter på celle-funksjon, også utover klassiske messenger-til-effektor kaskader 5,6.
Undersøke slike endringer i indusert reseptor trafficking er vanskelig. Alle tilgjengelige teknikker innebærer begrensninger. Biotin beskyttelse analyser har blitt brukt til Monitor overflatereseptorer populasjoner. Disse reseptorene er biotinylert og en tidsforløpet av immunoutfellinger er utført for å kvantifisere reduksjons i biotinylerte reseptorene over tid. Denne teknikken overvåker hovedsakelig den gradvise nedbrytning av en innledende, merket, populasjon av 7-reseptorer, og er svært nyttig i å lage tidsforløp i denne prosessen. Dessverre er denne analysen ikke i stand til å overvåke en hvilken som helst annen enn nedbrytning av den opprinnelige pool av reseptorer, slik som internalisering, gjenvinning, eller nye reseptorer prosess. Dessuten kan tilsetningen av et antistoff i 150kDa området til en reseptor på 50 kDa området forandre reseptorens handelen 8,9, og denne teknikk kan være vanskelig å bruke med lave nivå reseptorer.
Andre prosedyrer bruke ulike metoder for å identifisere intracellulære smugler avdelinger (f.eks endosomer, etc.) og vurdere deres colocalization med reseptorene av interesse. Dette inkluderer osse av heterologe systemer uttrykker fluorescerende protein-merket kimære konstruksjoner av reseptorene og kupé markører (f.eks Rab-familien GTPases). Dette gjør potensielt bruk av levende-cell imaging, fjerne problemstillinger knyttet til fiksering og permeabilization. Mens kraftig, lider en slik strategi fra de samme begrensningene av heterologe systemer generelt: Tag og ekspresjonsnivået effekter på oppførsel handel og inkompatibilitet med flere fysiologisk representative celletyper. Mer populært, er fargestoffer som brukes for enkelt å merke intracellulære (f.eks lysosomer, tilsynelatende) 10. Fargestoffer, men kan mangle spesifisitet (alle sure organeller i tilfelle av fargestoffer for lysosomer) og ikke vurdere menneskehandel gjennom andre avdelinger. Likevel, disse teknikkene tillater betydelig kontroll over systemet og eksperimentelle forhold og kan dra nytte av colocalization analysemetoder som presenteres her, nedenfor.
Metoden we tilstede her foredler sporing av reseptoren trafficking av colocalization. Ved å bruke immunocytokjemi (ICC) å merke egnede markører, er det mulig å identifisere flere forskjellige intracellulære. Dette tillater også bruk av fysiologisk relevante primære cellekulturer på plass av heterologe systemer. Denne ICC-protokollen innebærer fikse cellene av interesse før merking; Dette tillater merking på et bestemt endepunktet etter behandling (er). Dette gir et øyeblikksbilde av globale reseptor-kupé foreninger på det endepunktet. Med flere tidspunkt, kan en tidsforløpet av trafikkendringer også bygges.
Kort, celler er narkotika behandlet, merket for reseptoren og intracellulære rommet av interesse, confocally avbildes, og photomicrographs analyseres for matematisk kvantifisere colocalization av reseptoren og rommet 11. I vår bruk, undersøkte vi colocalization av en reseptor med Rab5, Rab11, og lysosomal-assosiert membran protein 1 (LAMP1). Disse markørene identifisere tidlige endosomer, resirkulering endosomes og lysosomer, hhv. Disse colocalization tiltakene fungerer som stedfortredere for de overordnede prosesser av internalisering, gjenvinning og degradering 12.
Som med alle teknikkene, skal noen begrensninger tas i betraktning. På grunn av behovet for å avbilde hver enkelt neuron analysert, kan denne teknikken bli ganske arbeidskrevende, avhengig av antall av tilstander og tidspunkter som er involvert. All immunolabeling må også kjempe med effekter på celle ultrastructure, protein lokalisering, og epitope tilgjengelighet forårsaket av fiksering og permeabilization 13.
Selv om det opprinnelig optimalisert for bruk med primærkulturer av primære sensoriske neuroner, er denne metoden i stor grad er kompatibel med andre monolagsbelagt kultur modeller.
Bruken av en matematisk kvantifisert Målte av colocalization er, spesielt, langt mer metodologisk stringente enn tidligere teknikker som brukes for å vurdere reseptor trafikkendringer, som ofte har støttet seg på vage, subjektive tiltak som visuelt inspisert flerkanals overlegg 14.
Denne teknikken er spesielt nyttig for sin brede kompatibilitet med in vivo intervensjoner (før primærkultur generasjon), in vitro intervensjoner (under kultur vekst), og ulike merking er rettet mot 15. Som sådan kan den bli tilpasset til mange forskjellige problemstillinger.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har optimalisert denne protokollen for analysen av primærkulturer av voksen dorsal root ganglion neuroner (primære sensoriske nevroner). Den kan også brukes, med liten eller ingen modifikasjon, for monolagsbelagt dyrkede celler bredt. Den colocalizational analyse er også mulig i vevssnitt og andre slike preparater 11, men de behandlings og vev fiksering / håndtering av komponenter ville ikke være passende.
Av interesse, kan ICC-metodene som presenteres her også benyttes,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av en bevilgning fra CIHR (MOP394808) og Canada Research Chair å CMCEWO var mottakeren av en Post-Graduate Scholarship fra NSERC.
Materials
| Trizma Base | Sigma Aldrich | T1503-500G | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888-500G | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Hydrochloric Acid | Sigma Aldrich | 258148 | |
| Albumin from Bovine Serum | Sigma Aldrich | A7906-100G | |
| Gelatin from cold water fish skin | Sigma Aldrich | G7041-100G | |
| Corning Costar Cell Culture Plates: 24-well | Fisher Scientific | 720084 | |
| 12 circle Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 1254580 | |
| Aqua/Poly-Mount | Polysciences | 18606-20 | |
| Sodium Phosphate Monobasic | Sigma Aldrich | S9638-500G | |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma Aldrich | S9763-500G | |
| Paraformaldehyde | Polysciences | 00380-1 | |
| Dumont #5 Forceps – Standard/Dumoxel | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Rabbit anti-DOR antibody | MyBioSource | MBS316175 | Used at 1:1500 |
| Mouse anti-Rab5 antibody | Sigma Aldrich | R7904 | Used at 1:750 |
| Mouse anti-Rab11 antibody | Millipore | 05-853 | Used at 1:500 |
| Goat anti-LAMP1 antibody | Santa Cruz | SC8098 | Used at 1:750 |
| Donkey anti-rabbit Alexa 488 conjugated antibody | Life Technologies | A-21206 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Goat anti-mouse Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11005 | Used at 1:200 to 1:2000 |
| Donkey anti-goat Alexa 594 conjugated antibody | Life Technologies | A-11058 | Used at 1:200 to 1:2000 |
References
- Drake, M. T., Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Trafficking of G protein-coupled receptors. Circ. Res. 99 (6), 570-582 (2006).
- Hanyaloglu, A. C., von Zastrow, M. Regulation of GPCRs by endocytic membrane trafficking and its potential implications. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48, 537-568 (2008).
- Hislop, J. N., von Zastrow, M. Role of ubiquitination in endocytic trafficking of G-protein-coupled receptors. Traffic. 12 (2), 137-148 (2011).
- Nagi, K., Piñeyro, G. Regulation of opioid receptor signalling: implications for the development of analgesic tolerance. Mol. Brain. 4 (1), 25 (2011).
- Whistler, J. L., Enquist, J., et al. Modulation of postendocytic sorting of G protein-coupled receptors. Science. 297 (5581), 615-620 (2002).
- Von Zastrow, M. Regulation of opioid receptors by endocytic membrane traffic: mechanisms and translational implications. Drug Alcohol Depend. 108 (3), 166-171 (2010).
- Milan-Lobo, L., Whistler, J. L. Heteromerization of the µ- and δ-opioid receptors produces ligand-biased antagonism and alters µ-receptor trafficking. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337 (3), 868-875 (2011).
- Wang, H. -. B., Guan, J. -. S., Bao, L., Zhang, X. Distinct subcellular distribution of delta-opioid receptor fused with various tags in PC12 cells. Neurochem. Res. 33 (10), 2028-2034 (2008).
- Scherrer, G., Tryoen-Tóth, P., et al. Knockin mice expressing fluorescent delta-opioid receptors uncover G protein-coupled receptor dynamics in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. 103 (25), 9691-9696 (2006).
- He, S. -. Q., Zhang, Z. -. N., et al. Facilitation of µ-opioid receptor activity by preventing δ-opioid receptor-mediated codegradation. Neuron. 69 (1), 120-131 (2011).
- French, A. P., Mills, S., Swarup, R., Bennett, M. J., Pridmore, T. P. Colocalization of fluorescent markers in confocal microscope images of plant cells. Nat. Protoc. 3 (4), 619-628 (2008).
- Ong, E. W., Xue, L., Olmstead, M. C., Cahill, C. M. Prolonged morphine treatment alters δ opioid receptor post-internalization trafficking. Br. J. Pharmacol. 172 (2), 615-629 (2014).
- Schnell, U., Dijk, F., Sjollema, K. a. Immunolabeling artifacts and the need for live-cell imaging. Nature Methods. 9 (2), 152-158 (2012).
- Rozenfeld, R., Gupta, A., Devi, L. A. Cell surface targeting of mu-delta opioid receptor heterodimers by RTP4. Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (41), 16045-16050 (2008).
- Gupta, A., Mulder, J., et al. Increased abundance of opioid receptor heteromers after chronic morphine administration. Sci. Signal. 3 (131), ra54 (2010).
- Seibenhener, M. L., Wooten, M. W. Isolation and culture of hippocampal neurons from prenatal mice. J. Vis. Exp. (65), 1-7 (2012).
- Bolte, S., Cordelières, F. P. A guided tour into subcellular colocalization analysis in light microscopy. J. Microsc. 224 (Pt 3), 213-232 (2006).
- Field, A., Miles, J., Field, Z. . Discovering Statistics Using R. , (2012).
- Mattioli, T. -. A. M., Milne, B., Cahill, C. M. Ultra-low dose naltrexone attenuates chronic morphine-induced gliosis in rats. Mol. Pain. 6, 22 (2010).
- Vogt, R. F., Phillips, D. L., Henderson, L. O., Whitfield, W., Spierto, F. W. Quantitative differences among various proteins as blocking agents for ELISA microtiter plates. J. Immunol. Methods. 101 (1), 43-50 (1987).
- Johnson, I., Spence, M. . The Molecular Probes Handbook. , (2010).
- Morris, T. J., Stanley, E. F. A simple method for immunocytochemical staining with multiple rabbit polyclonal antibodies. J. Neurosci. Methods. 127 (2), 149-155 (2003).
- Pawley, J. . Handbook of Biological Confocal Microscopy. , (2006).
- North, A. J. Seeing is believing? A beginners’ guide to practical pitfalls in image acquisition. J. Cell Biol. 172 (1), 9-18 (2006).
- Zinchuk, V., Zinchuk, O., Okada, T. Quantitative colocalization analysis of multicolor confocal immunofluorescence microscopy images: pushing pixels to explore biological phenomena. Acta Histochem. Cytochem. 40 (4), 101-111 (2007).
