In situ detectie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een gemerkte DNA-Digoxine Probe Targeting 16S rRNA
Summary
Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Abstract
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Introduction
Bacteriën spelen een rol in de etiologie van diverse orale aandoeningen zoals periodontitis, pulpitis, pericoronitis, cellulitis en osteomyelitis. Om de rol van bacteriën in de pathogenese van de ziekte te begrijpen en het effect van behandeling te controleren, lokalisatie van bacteriën in het weefsel van belang. De aanwezigheid van bacteriën in gingivale weefsel van patiënten met periodontitis is aangetoond met behulp van verschillende methoden, waaronder elektronenmicroscopie 1,2, immunohistochemie en immunofluorescentie middel van bacteriën antilichamen 3-7 en fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) 8 met een fluorescentie- gelabelde oligonucleotideprobe gericht op 16S rRNA. Toch zijn deze methoden niet op grote schaal gebruikt vanwege technische beperking of moeilijkheden. Vergeleken met antilichamen, probes gericht 16S rRNA zijn gemakkelijk te produceren en het bereiken species-specificiteit. FISH heeft bewezen een uitstekend hulpmiddel voor de visualisatie van bact zijneria in hun natuurlijke omgevingen zoals plaque biofilm. De toepassing van FISH weefselmonsters is beperkt door autofluorescentie van verschillende weefselcomponenten. Bijvoorbeeld, de sterke autofluorescentie van rode bloedcellen vaak belemmert de toepassing van fluorescentietechnieken ontstoken weefsel wanneer zij omvatten bloeden 9.
Om binnen de ontstoken tandvleesweefsels bacteriën lokaliseren derhalve een in situ hybridisatie onder toepassing van een digoxigenine (DIG) -gemerkte DNA-probe is ontwikkeld en succesvol toegepast 10,11. Hier een gedetailleerd protocol voor de lokalisatie van bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp P. gingivalis-specifieke en universele eubacteriële probes beschreven. Het is met name gericht op standaardisatie van de werkwijze, zodat vergelijkbare resultaten kunnen worden weergegeven in andere laboratoria. Dit protocol maakt lokalisatie van bacteriën in hun histologische context en de results zijn zeer reproduceerbaar. De beschreven protocol kan worden gebruikt om bacteriën te lokaliseren hetzij een species-specifieke of universele wijze in verschillende weefsels. De universele probe is met name nuttig voor detecteren van bacteriën in polymicrobiële ziekten en een potentiële rol bacteriën bestuderen ziekten waarbij de rol van specifieke bacteriën niet bekend.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier een protocol bij bacteriën in paraffine ingebedde weefsels met behulp van een DIG-gemerkte DNA probe is beschreven lokaliseren. De probe richt de DNA- of RNA-moleculen van bacteriële 16S rRNA-gen en het 16S rRNA-targeting probes worden ontworpen zoals deze species-specifieke of universele. De specifieke hybridisatie van het P. gingivalis -specifieke probe P. gingivalis maar niet met andere orale bacteriën werd aangetoond 10. In tegenstelling, de eubacteriële probe hybridiseerde met …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door een subsidie (2013R1A1A3005669) van de National Research Foundation Korea en een subsidie (HI13C0016) van de Koreaanse Health Technology R & D Project, Ministerie van Volksgezondheid en Welzijn.
Materials
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
