16S rRNA의 타겟팅 디곡신 표지 DNA 프로브를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 제자리 검출
Summary
Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Abstract
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Introduction
박테리아는 치주염, 치수염, pericoronitis, 봉와직염, 골수염과 같은 다양한 구강 질환의 병인에 중요한 역할을한다. 질병의 발병 기전에서 세균의 역할을 이해하고 치료의 효과를 모니터링하기 위하여, 조직 내의 박테리아의 현지화 중요하다. 치주염 환자의 치은 조직 내의 박테리아의 존재는 fluorescence-를 사용하여 계내 혼성화 (FISH) 8 전자 현미경 1,2, 면역 조직 화학 및 면역 이용한 박테리아 특이 항체 3-7 및 형광체를 포함하여, 다양한 방법을 이용하여 도시 한 16S rRNA의 타겟팅 된 표지 된 올리고 뉴클레오티드 프로브. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법은 널리 기술적 한계 나 어려움에 사용되지 않습니다. 항체와 비교하는 16s rRNA를 타겟팅 프로브 생산 종 특이성을 달성하기 쉽다. 물고기는 BACT의 시각화를위한 훌륭한 도구가 될 입증되었습니다이러한 플라크 바이오 필름 등의 자연 환경에서 eria. 그러나, 조직 샘플에 대한 FISH의 적용으로 인해 다양한 조직 성분의자가 형광에 한정된다. 그들은 9 출혈 것을 포함 할 때, 예를 들어, 적혈구의 강한 형광도는 종종 염증 조직으로 형광 기술의 적용을 방해.
염증 잇몸 조직 내의 박테리아를 지역화하기 위해, 따라서, 디곡 시게 닌을 사용하여 동일계에서 혼성화 방법 (DIG) 표지 된 DNA 프로브를 개발되었으며 10,11 성공적으로 적용 하였다. 피를 사용하여 파라핀 조직 내에서 박테리아의 현지화에 대한 다음은 상세한 프로토콜 진지 발리 – 특정 보편적 eubacterial 프로브는 설명 하였다. 이것은 특히 유사한 결과가 다른 실험실에서 재현 될 수 있도록하는 방법의 표준화에 집중된다. 이 프로토콜은 자신의 조직 학적 상황과 resu 내 박테리아의 현지화를 할 수 있습니다LTS는 높은 재현성 있습니다. 설명 프로토콜은 어느 다양한 조직에서 종 특이 또는 범용 방식 박테리아 지역화하는데 사용될 수있다. 범용 프로브는 polymicrobial 질환 박테리아를 검출하고 특정 박테리아의 역할을 알 수없는 경우 질병에 박테리아의 잠재적 인 역할을 연구하는 데 특히 유용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 프로토콜 설명 하였다 DIG 표지 된 DNA 프로브를 사용하는 파라핀 포매 조직 내의 박테리아를 지역화. 프로브는 세균 16S rRNA 유전자의 DNA 또는 RNA 분자를 표적으로하고, 16S rRNA의 타겟팅 프로브는 어느 종 특이 또는 범용으로 설계 될 수있다. (P)의 구체적인 하이브리드 경찰에 진지 발리 – 특정 프로브 진지 발리 아니라 다른 구강 박테리아는 이전에 (10)를 보였다. …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
본 연구는 한국 연구 재단에서 보조금 (2013R1A1A3005669)와 한국 보건 기술의 R & D 사업, 보건 복지부의 허가 (HI13C0016)에 의해 지원되었다.
Materials
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
