Summary

La detección in situ de las bacterias dentro de los tejidos embebidos en parafina utilizando un ADN sonda digoxina marcada focalización 16S rRNA

Published: May 21, 2015
doi:

Summary

Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Abstract

The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.

Introduction

Las bacterias desempeñan un papel en la etiología de diversas enfermedades orales tales como periodontitis, pulpitis, pericoronitis, celulitis, y osteomielitis. Con el fin de comprender el papel de las bacterias en la patogénesis de la enfermedad y para controlar el efecto de los tratamientos, la localización de las bacterias dentro del tejido es importante. La presencia de bacterias en el tejido gingival de pacientes con periodontitis se ha demostrado usando varios métodos, incluyendo microscopía electrónica de 1,2, inmunohistoquímica e inmunofluorescencia utilizando anticuerpos específicos de bacterias 3-7, y la hibridación fluorescente in situ (FISH) usando un 8 por fluorescencia sonda de oligonucleótido marcada orientación 16S rRNA. Sin embargo, estos métodos no son ampliamente utilizados debido a la limitación técnica o dificultades. En comparación con anticuerpos, sondas dirigidas a 16S rRNA son fáciles de producir y lograr especificidad de especie. FISH ha demostrado ser una excelente herramienta para la visualización de bacteria en sus entornos naturales como el biofilm de la placa. Sin embargo, la aplicación de FISH a las muestras de tejido es limitado debido a la autofluorescencia de los diversos componentes del tejido. Por ejemplo, el fuerte autofluorescencia de las células rojas de la sangre a menudo dificulta la aplicación de la tecnología de fluorescencia para los tejidos inflamados cuando implican sangrado 9.

Con el fin de localizar las bacterias dentro de los tejidos gingivales inflamados, por lo tanto, un método de hibridación in situ utilizando un digoxigenina (DIG) sonda de ADN marcada con se ha desarrollado y aplicado con éxito 10,11. Aquí un protocolo detallado para la localización de las bacterias dentro de los tejidos incluidos en parafina utilizando P. gingivalis sondas específicos de eubacterial y universales se ha descrito. Se centra sobre todo en la estandarización del método de manera que resultados similares se pueden reproducir en otros laboratorios. Este protocolo permite la localización de las bacterias dentro de su contexto histológico y el results son altamente reproducible. El protocolo descrito se puede utilizar para localizar las bacterias ya sea de una manera específica de la especie o universal en varios tejidos. La sonda universal es especialmente útil para detectar bacterias en enfermedades polimicrobianas y para estudiar un posible papel de las bacterias en enfermedades en las que no se conoce el papel de las bacterias específicas.

Protocol

1. Preparación de la sonda La amplificación por PCR de la sonda Para el P. sonda gingivalis específico de, amplificar un fragmento de ADN de 343 pb de P. gingivalis 16S rRNA mediante PCR utilizando el ADN genómico de P. gingivalis y los siguientes cebadores: 5'-TGC AAC TTG CCT TAC AGA GG-3 'y 5' ACTUAR CGT ATC GCC CGT TAT TC-3 '10. Realizar amplificaciones con las siguientes condiciones de ciclo: 35 ciclos a 95 ° C durante 30 seg, 60…

Representative Results

La Figura 1 muestra dot blotting de sondas marcadas con DIG en comparación con la sonda de control positivo proporcionado en el kit para determinar su sensibilidad. El 343 pb P. sonda específico de gingivalis es 25 veces más sensible que la sonda eubacterial 70 pb. La Figura 2 muestra la hibridación in situ de los tejidos gingivales obtenidas de pacientes con periodontitis crónica para la detección de P. gingivalis y eubacterias. Las señales ba…

Discussion

Aquí un protocolo para localizar las bacterias dentro de los tejidos embebidos en parafina utilizando una sonda de ADN marcada con DIG que se ha descrito. La sonda se dirige a las moléculas de ADN o ARN de origen bacteriano gen 16S rRNA, y las sondas de ARNr 16S-direccionamiento puede ser diseñado como cualquiera de las especies-específico o universal. La hibridación específica de la P. sonda específico de gingivalis a P. gingivalis pero no a otras bacterias orales se ha demostrado prev…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por una beca (2013R1A1A3005669) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea y una subvención (HI13C0016) de la coreana Salud Tecnología Proyecto I + D del Ministerio de Salud y Bienestar Social.

Materials

Acetic anhydride Sigma 6404
50% Dextran sulfate solution Millipore S4030
50X Denhardt’s solution Sigma D2532
DEPC Sigma P159220
DIG DNA labeling and detection kit Roche 11 093 657 910
Formamide Sigma F9037
ImmEdge™ Pen Dako H-400
Levamisole Vector SP-5000
Magnesium chloride Sigma 246964
Maleic acid Sigma M0375
Methyl green Sigma M6776
Paraformaldehyde Sigma P1648
Permount Fisher SP15-500
Salmon sperm DNA solution Invitrogen #15632-011
Sodium chloride Sigma S9625
Sodium citrate Duksan D1420
Sodium dodecyl sulfate Amresco 227
Triethanolamine-HCl Sigma 90279
Tris-HCl Research organics 3098T

References

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Cite This Article
Choi, Y. S., Kim, Y. C., Baek, K. J., Choi, Y. In Situ Detection of Bacteria within Paraffin-embedded Tissues Using a Digoxin-labeled DNA Probe Targeting 16S rRNA. J. Vis. Exp. (99), e52836, doi:10.3791/52836 (2015).

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