In situ påvisning af bakterier i paraffinindlejrede Væv Brug en Digoxin-mærket DNA Probe Målretning 16S rRNA
Summary
Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled 16S rRNA-targeting DNA probes has been described. This protocol can be applied to study the role of bacteria in various diseases such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Abstract
The presence of bacteria within the pocket epithelium and underlying connective tissue in gingival biopsies from patients with periodontitis has been reported using various methods, including electron microscopy, immunohistochemistry or immunofluorescence using bacteria-specific antibodies, and fluorescent in situ hybridization (FISH) using a fluorescence-labeled oligonucleotide probe. Nevertheless, these methods are not widely used due to technical limitation or difficulties. Here a method to localize bacteria within paraffin-embedded tissues using DIG-labeled DNA probes has been introduced. The paraffin-embedded tissues are the most common form of biopsy tissues available from pathology banks. Bacteria can be detected either in a species-specific or universal manner. Bacterial signals are detected as either discrete forms (coccus, rod, fusiform, and hairy form) of bacteria or dispersed forms. The technique allows other histological information to be obtained: the epithelia, connective tissue, inflammatory infiltrates, and blood vessels are well distinguished. This method can be used to study the role of bacteria in various diseases, such as periodontitis, cancers, and inflammatory immune diseases.
Introduction
Bakterier spiller en rolle i ætiologien af forskellige orale sygdomme, såsom periodontitis, pulpitis, pericoronitis, cellulitis, og osteomyelitis. For at forstå den rolle bakterier i patogenesen af sygdommen og til at overvåge virkningen af behandlinger, lokalisering af bakterier i vævet er vigtig. Tilstedeværelsen af bakterier i gingival væv fra patienter med parodontitis er blevet vist under anvendelse af forskellige metoder, herunder elektronmikroskopi 1,2, immunhistokemi og immunofluorescens under anvendelse bakterier-specifikke antistoffer 3-7, og fluorescerende in situ-hybridisering (FISH) under anvendelse af en 8 fluorescence- mærket oligonukleotidprobe målretning 16S rRNA. Ikke desto mindre er disse metoder ikke udbredt på grund af den tekniske begrænsning eller vanskeligheder. Sammenlignet med antistoffer, er nemme at fremstille og opnå artsspecificitet prober rettet mod 16S rRNA. FISH har vist sig at være et fremragende værktøj til visualisering af Bacteria i deres naturlige miljøer såsom plak biofilm. Imidlertid er anvendelse af fisk til vævsprøver begrænset på grund af autofluorescens af forskellige væv komponenter. For eksempel er den stærk autofluorescens af røde blodlegemer ofte hæmmer anvendelsen af fluorescens-teknologi til betændte væv, når de involverer blødning 9.
For at lokalisere bakterier inden for de betændte gingivale væv derfor et in situ-hybridisering metoden i en digoxigenin (DIG) -mærket DNA-probe er blevet udviklet og anvendt med succes 10,11. Her en detaljeret protokol for lokaliseringen af bakterier inden paraffinindlejrede væv ved hjælp af P. gingivalis-specifikke og universelle eubakterielle prober er blevet beskrevet. Det er især fokuseret på standardisering af den metode, således at lignende resultater kan reproduceres i andre laboratorier. Denne protokol muliggør lokalisering af bakterier i deres histologiske sammenhæng og results er meget reproducerbare. Den beskrevne protokol kan anvendes til at lokalisere bakterier enten i en artsspecifik eller universel måde i forskellige væv. Den universelle probe er især nyttig til at detektere bakterier i polymikrobielle sygdomme og til at undersøge en potentiel rolle af bakterier i sygdomme, hvor rollen af specifikke bakterier ikke er kendt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her en protokol til at lokalisere bakterier i paraffinindlejrede væv under anvendelse af en DIG-mærket DNA-probe er blevet beskrevet. Sonden er rettet mod de DNA eller RNA-molekyler af bakteriel 16S rRNA-genet, og 16S rRNA-målretning prober kan være udformet som enten artsspecifik eller universel. Den specifikke hybridisering af P. gingivalis-specifik probe til P. gingivalis men ikke til andre orale bakterier er tidligere blevet vist 10. I modsætning hertil eubakterielle probe hybridise…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne undersøgelse blev støttet af en bevilling (2013R1A1A3005669) fra Grundforskningsfonden Korea og et tilskud (HI13C0016) af den koreanske Health Technology R & D Project, Ministeriet for Sundhed og Velfærd.
Materials
| Acetic anhydride | Sigma | 6404 | |
| 50% Dextran sulfate solution | Millipore | S4030 | |
| 50X Denhardt’s solution | Sigma | D2532 | |
| DEPC | Sigma | P159220 | |
| DIG DNA labeling and detection kit | Roche | 11 093 657 910 | |
| Formamide | Sigma | F9037 | |
| ImmEdge™ Pen | Dako | H-400 | |
| Levamisole | Vector | SP-5000 | |
| Magnesium chloride | Sigma | 246964 | |
| Maleic acid | Sigma | M0375 | |
| Methyl green | Sigma | M6776 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P1648 | |
| Permount | Fisher | SP15-500 | |
| Salmon sperm DNA solution | Invitrogen | #15632-011 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9625 | |
| Sodium citrate | Duksan | D1420 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Amresco | 227 | |
| Triethanolamine-HCl | Sigma | 90279 | |
| Tris-HCl | Research organics | 3098T |
References
- Takarada, H., Cattoni, M., Sugimoto, A., Rose, G. G. Ultrastructural studies of human gingiva. II. The lower part of the pocket epithelium in chronic periodontitis. J. Periodontol. 45 (3), 155-169 (1974).
- Allenspach-Petrzilka, G. E., Guggenheim, B. Bacterial invasion of the periodontium; an important factor in the pathogenesis of periodontitis. J. Clin. Periodontol. 10 (6), 609-617 (1983).
- Saglie, F. R., et al. The presence of bacteria in the oral epithelium in periodontal disease. II. Immunohistochemical identification of bacteria. J. Periodontol. 57 (8), 492-500 (1986).
- Christersson, L. A., Albini, B., Zambon, J. J., Wikesjö, U. M., Genco, R. J. Tissue localization of Actinobacillus actinomycetemcomitans. in human periodontitis. I. Light, immunofluorescence and electron microscopic studies. J. Periodontol. 58 (8), 529-539 (1987).
- Saglie, F. R., Pertuiset, J., Rezende, M. T., Nestor, M., Marfany, A., Cheng, J. In situ. correlative immuno-identification of mononuclear infiltrates and invasive bacteria in diseased gingiva. J. Periodontol. 59 (10), 688-696 (1988).
- Rautemaa, R., et al. Intracellular localization of Porphyromonas gingivalis. thiol proteinase in periodontal tissues of chronic periodontitis patients. Oral Dis. 10 (5), 298-305 (2004).
- Marttila, E., et al. Intracellular localization of Treponema denticola. chymotrypsin-like proteinase in chronic periodontitis. J. Oral Microbiol. 6, (2014).
- Colombo, A. V., da Silva, C. M., Haffajee, A., Colombo, A. P. Identification of intracellular oral species within human crevicular epithelial cells from subjects with chronic periodontitis by fluorescence in situ. hybridization. J. Periodontal Res. 42 (3), 236-243 (2007).
- Abrams, K., Caton, J., Polson, A. Histologic comparisons of interproximal gingival tissues related to the presence or absence of bleeding. J. Periodontol. 55 (11), 629-632 (1984).
- Kim, Y. C., et al. Presence of Porphyromonas gingivalis. and plasma cell dominance in gingival tissues with periodontitis. Oral Dis. 16 (4), 375-381 (2010).
- Choi, Y. S., et al. Porphyromonas gingivalis. and dextran sodium sulfate induce periodontitis through the disruption of physical barriers. Eur. J. Inflammation. 10, 419-431 (2013).
- Choi, Y. S., Kim, Y. C., Ji, S., Choi, Y. Increased bacterial invasion and differential expression of tight junction proteins, growth factors, and growth factor receptors in periodontal lesions. J. Periodontol. 85 (8), e313-e322 (2014).
- Baker, G. C., Smith, J. J., Cowan, D. A. Review and re-analysis of domain-specific 16S primers. J. Microbiol. Methods. 55 (3), 541-555 (2003).
- Hajishengallis, G., et al. A Low-abundance biofilm species orchestrates inflammatory periodontal disease through the commensal microbiota and the complement. Cell Host Microbe. 10 (5), 497-506 (2011).
- Axon, A. Gastric cancer and Helicobacter pylori. Aliment. Pharmacol. Ther. 16 (suppl. 4), 83-88 (2002).
- Fenhalls, G., et al. In situ. detection of Mycobacterium tuberculosis transcripts in human lung granulomas reveals differential gene expression in necrotic lesions. Infect. Immun. 70 (11), 6330-6338 (2002).
