Summary

Un metodo per Remotely Silencing Neural Activity in Roditore Durante Fasi discreti di apprendimento

Published: June 22, 2015
doi:

Summary

This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.

Abstract

Questo protocollo descrive come disattivare temporaneamente e in remoto l'attività neuronale in regioni cerebrali discrete mentre gli animali sono impegnati in compiti di apprendimento e memoria. L'approccio combina farmacogenetica (Designer-recettori-Esclusivamente-Activated-by-Designer-droga) con un paradigma comportamentale (precondizionamento sensoriale) che è stato progettato per distinguere tra le diverse forme di apprendimento. In particolare, la consegna virale-mediata è usato per esprimere un recettore G-proteina inibitrice geneticamente modificata accoppiata (Progettazione Receptor) in una regione del cervello discreta nei roditori. Tre settimane più tardi, quando i livelli di espressione del recettore del progettista sono alti, un agente farmacologico (Designer Drug) viene somministrato per via sistemica 30 minuti prima di una sessione specifica del comportamento. Il farmaco ha affinità per il recettore progettista e pertanto provoca l'inibizione di neuroni che esprimono il recettore progettista, ma è altrimenti biologicamente inerte. La regione del cervello rimane a tacere per 2-5 ore (Depending dalla dose e via di somministrazione). Al termine del paradigma comportamentale, tessuto cerebrale viene valutata per il corretto posizionamento e l'espressione del recettore. Questo approccio è particolarmente utile per determinare il contributo di regioni cerebrali singoli componenti specifici di comportamento e può essere utilizzato in qualsiasi numero di paradigmi comportamentali.

Introduction

Una sfida emozionante nel campo delle neuroscienze del comportamento è quello di determinare i substrati neurali di comportamenti complessi. Un certo numero di tecniche come lesioni permanenti, inattivazione cervello temporaneo tramite impianti cannule e optogenetics sono stati impiegati per identificare i contributi di regioni cerebrali discreti per sottocomponenti di comportamenti complessi. Mentre questi approcci informano la nostra comprensione della specificità regionale durante l'apprendimento, ogni tecnica non è senza limiti. In particolare, le lesioni permanenti sono tipicamente condotte prima della prova comportamentale, quindi sono presenti in tutta la durata del paradigma loro effetti. Studi Incannulazione che comportano la presentazione di un inattivatore neurali a breve termine (ad esempio, la tetrodotossina) in grado di produrre danni rilevanti al tessuto cerebrale e possono indurre lo stress in soggetti appena prima del test comportamentali. Inoltre, inattivazione tramite cannulazione è limitata alla regione di tessuto che circonda lapunta delle cannule. Infine, mentre optogenetics offre una gamma di flessibilità per il controllo temporale dell'attività in regioni specifiche del cervello, è costo proibitivo e tecnicamente esigenti.

Queste limitazioni possono essere superate con un approccio farmacogenetica (Designer-recettori-Esclusivamente-Activated-by-Designer-Farmaci, DREADDs) 1,2. È importante sottolineare che, mentre il concetto di farmacogenetica è sofisticata, l'esecuzione della tecnica è semplice. Simili metodi chirurgici stereotassica tradizionali che prevedono l'infusione di tossina (ad esempio, NMDA, ibotenico) in regioni cerebrali discrete, questa tecnica comporta infondendo un virus adeno-associato (AAV) che contiene un frammento di DNA per un recettore G-proteina inibitoria modificato accoppiato (hM4Di; il recettore designer) nella regione di interesse di roditori di laboratorio standard (vedi Figura 1). Il vettore virale contiene anche un reporter fluorescente (mcitrine). Una volta costituita inalle cellule, il recettore designer (e proteina reporter) sono massimamente espressi ~ 3 settimane post-infusione e possono essere selettivamente attivati ​​per 2-5 ore dalla somministrazione sistemica del farmaco progettista altrimenti biologicamente inerte, clozapina-N-ossido (CNO) 1 , 3. Poiché lo sperimentatore è dotato di preciso, ma a distanza di controllo temporale su attività neurale in specifiche regioni del cervello, farmacogenetica abbina particolarmente bene con paradigmi comportamentali che si svolgono in più fasi. In questo esempio, il contributo della corteccia retrosplenial (RSC) a stimolo-stimolo di apprendimento viene confrontato con il suo ruolo nell'apprendimento pavloviano, ma questa combinazione di approcci ben si adatta a qualsiasi numero di domande che cercano di identificare come specifiche regioni del cervello contribuiscono a comportamento complesso.

Inoltre, pur non descritto nel presente protocollo, approcci virali e transgeniche possono essere utilizzati per ottenere specifici tipi cellulari espressione DREADD 2. Come hos inerente a paradigmi comportamentali che coinvolgono farmacologici e / o di altri tipi di manipolazioni sperimentali, un attento esame del disegno sperimentale e la successiva analisi quantitativa è necessaria quando si impiega il metodo DREADD. Sperimentatori nuovi all'approccio DREADD si riferiscono a una rassegna completa delle attuali tecnologie DREADD 2.

Ogni giorno, gli organismi conoscere nuovi stimoli e gli eventi e le loro relazioni gli uni agli altri. Anche in un ambiente familiare, come la casa, uno è rapido per rilevare alterazioni nei rapporti tra stimoli perché questi cambiamenti possono essere predittivi di eventi significativi. Tale stimolo-stimolo (ad esempio, relazionale) apprendimento implica la congiunzione di stimoli multipli ed è stato tradizionalmente associato con l'ippocampo, che risiede in posizione centrale all'interno del lobo temporale mediale 4. Tuttavia, l'ippocampo non esiste nè agire isolatamente; regioni corticali sia all'interno e fuorilato del lobo temporale mediale fornire informazioni critiche sensoriali alla formazione dell'ippocampo 5-7. Tradizionali studi lesioni permanenti forniscono prove del coinvolgimento di un certo numero di regioni corticali (ad esempio, le cortecce retrosplenial, postrhinal e entorinale) nell'apprendimento ippocampo-dipendente, ma sono limitate nella loro capacità di discernere il ruolo di una regione particolare durante le fasi discrete di apprendimento 8-10.

Il presente protocollo verifica l'ipotesi che la RSC è necessaria per l'apprendimento stimolo-stimolo silenziando RSC durante una singola fase di un 3-fase di precondizionamento sensoriale paradigma 11,12. Brevemente, ratti ricevono infusioni di un AAV che contiene il recettore progettista e ~ 3 settimane dopo sono somministrato il farmaco designer (CNO) 30 min prima dell'inizio della prova comportamentale. Nel presente protocollo, i topi sperimentali ricevono CNO durante la prima fase di test (quando stimolo-stimolo learning si verifica) e ricevono veicolo durante i prossimi 2 fasi di test. Per controllare gli effetti involontari di CNO sul comportamento, infondere ratti con il recettore designer (hM4Di) e iniettare con veicolo al posto del CNO. Per tenere conto di effetti generali di infusione virale e l'espressione del recettore, infondere un virus di controllo che non contiene il recettore designer e amministrare CNO.

Un certo numero di differenti sierotipi di AAV sono usati per fornire materiale genetico. Le attuali linee guida NIH per la ricerca coinvolgimento ricombinante o molecole sintetiche sostiene che AAV (tutti i sierotipi) e costrutti AAV ricombinanti o sintetici, in cui il transgene non codifica sia un prodotto del gene potenzialmente cancerogeno o una molecola di tossina e sono prodotti in assenza di un virus helper, richiedono BSL-1 precauzioni (Gruppo Appendice B-1. rischio 1 (RG1) agenti) 13. Un numero di recensioni relative alla struttura AAV, l'utilità e la sicurezza sono disponibili 14,15. In particolare, anche se, A causa delle preoccupazioni relative a possibili riproduttivi 16,17 e meccanismi potenziali cancerogeni 18-20 nei roditori, alcuni istituti richiedono l'uso di BSL-2 precauzioni quando si lavora con AAV. Verificare il BSL appropriata prima dell'uso attraverso la consultazione con i comitati di sorveglianza a singole istituzioni dove la ricerca sarà condotta, i Centers for Disease Control e le Linee Guida NIH per la ricerca che coinvolge DNA ricombinante Molecole 13 quando si utilizza vettori virali per la manipolazione genetica negli Stati Uniti. Protezione personale, formazione investigatore, vettore di contenimento, di decontaminazione, di smaltimento dei materiali decontaminati, e animali post-iniezione esigenze abitative sono specificati da queste linee guida. Inoltre, consultare e seguire appropriate Animal Care istituzionali e utilizzare le linee guida del comitato o orientamento equivalente di Vigilanza istituzionali per garantire la manipolazione, somministrazione e lo smaltimento di AAV.

Protocol

L'uso di animali sono approvati dalla Oberlin College Istituzionale Animal Care and Use Committee e sono conformi alla Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio 21. 1. Preparazione per Infusione virale Nota: Questo protocollo utilizza BSL-1 precauzioni. Quando si impiegano BSL-2 precauzioni, un camice da laboratorio e getta, guanti, copriscarpe, protezioni oculari e un respiratore per particolati (tipo N95) sono obbligatori. Tutte le pe…

Representative Results

Risultati comportamentali Al termine dell'esperimento, l'efficacia della inattivazione temporanea regione specifica deve essere valutata quantitativamente e qualitativamente. Il presente esempio riguarda un paradigma 3 fasi comportamentale (precondizionamento sensoriale), in cui è stato somministrato CNO attenuare attività neurale nel RSC durante le sessioni di precondizionamento per verificare l'ipotesi che la RSC è necessario per la formazione di associazioni tra stimoli neutro…

Discussion

Questo protocollo descrive come applicare un approccio farmacogenetica (DREADD) per studiare come una regione del cervello specifica contribuisce ad un più fasi compito di apprendimento complesso. Con la possibilità di disattivare temporaneamente e in remoto attività neurale in regioni cerebrali distinte attraverso fasi di apprendimento, questa combinazione di approcci fornisce una piattaforma per indagare su una vasta gamma di comportamenti, tra cui forme più sfumate o mascherate di apprendimento. Nell'esempio …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo di Robinson et al. 12 gli autori per il loro contributo il manoscritto da cui questo protocollo è parzialmente derivato.

Materials

Male, Long Evans Rats, 55-60 d Hilltop Lab Animals Inc
rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine Virus Vector Core Caution:  This is a BSL-1 compound
rAAV8/hSyn-GFP Virus Vector Core Caution:  This is a BSL-1 compound
Clozapine-N-Oxide R&D Systems 4936-10 Designer Drug
Rat Cage lid (Polycarbonate) Alternative Design  FT 8XL-PC Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion
Filer Paper (Replacement) Alternative Design  FP-R-1018XAD Filter paper that goes with cage lids
Table Top Vise JETS 2201-265 For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood
Medline Biohazard liners  Staples 113444 Biohazard Trash Bags
United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle  Amazon.com Biohazard Trash Can
Isoflurane, 100 mL Patterson Veterinary Supply Inc.  07-890-8540 Anesthetic
Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console David Kopf Model 942 Surgical equipment
Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat) David Kopf Model 955 Surgical equipment
Anesthesia Mask (Rat) David Kopf Model 906 Surgical equipment
High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder David Kopf Model 1474 Surgical equipment
Microdrill burrs, 0.9 mm Fine Science Tools Inc 19007-09 Surgical supply
Automated Syringe pump with Micro4 Controller  David Kopf Model UMP3-1 Surgical equipment
Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit Ahdis 21420 Surgical supply
Betadine Skin Cleanser Perdue  Products L.P 67618-149-04 Surgical supply
Triple Antiobiotic Ointment Medline Supply 53329-087-01 Surgical supply
Puralube Vet Ointment Only Veterinary Supply 17033-211-38 Surgical supply
Dino-lite  Microscope AD7013MTL An alternative to the traditional disection scope
Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand Microscope MS36B Surgical equipment
28 Gauge 10uL Syringe Hamilton  80308-701SN Surgical equipment
Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle Med Associates, Inc ENV-018MD 22'Wx22"Hx16"D
Extra Tall Modular Test Chamber Med Associates, Inc ENV-007 Behavioral equipment
Stainless Steel Grid Floor  Med Associates, Inc ENV-005 Behavioral equipment
House Light Med Associates, Inc ENV-215M Used as the house light and stimulus light
Modular Pellet Dispenser  Med Associates, Inc ENV-203M-45 Behavioral equipment
Pellet Recetacle, Cup Type Med Associates, Inc ENV-200R1M Behavioral equipment
Head Entry Detector for Rat Med Associates, Inc ENV-254-CB Behavioral equipment
Dustless precision food pellets, 45 mg Bio-Serv F0165 Behavioral supply
Cage Speaker for Rat Chamber Med Associates, Inc ENV-224AM Behavioral equipment
Programmable Audio Generator  Med Associates, Inc ANL-926 Behavioral equipment
Smart Ctrl 8 Input/16 output Package Med Associates, Inc DIG-716P2 Behavioral equipment
Large Table Top Cabinet and Power Supply Med Associates, Inc SG-6510D Behavioral equipment
PCI Interface Package Med Associates, Inc DIG-700P2-R2 Behavioral equipment
MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19" Monitor Med Associates, Inc COM-103V Behavioral equipment
Paraformaldehyde (grannular), 1 kg Electron Microsopy Sciences 19210 Hazard:  carcinogen, weigh in hood
Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag) Cell Signaling Technologies  3724S Histology reagent
XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) Cell Signaling Technologies  2956S Histology reagent
Anti-Rabbit IgG Cell Signaling Technologies  4412S Histology supplies
Superfrost Plus slides  VWR international 483111-703 Histology supplies

References

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Robinson, S., Adelman, J. S. A Method for Remotely Silencing Neural Activity in Rodents During Discrete Phases of Learning. J. Vis. Exp. (100), e52859, doi:10.3791/52859 (2015).

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