Un método para Remotamente silenciamiento actividad neural en roedores Durante fases discretas de aprendizaje
Summary
This protocol describes how to temporarily and remotely silence neuronal activity in discrete brain regions while rats are engaged in learning and memory tasks. The approach combines pharmacogenetics (Designer-Receptors-Exclusively-Activated-by-Designer-Drugs) with a behavioral paradigm (sensory preconditioning) that is designed to distinguish between different components of learning.
Abstract
Este protocolo describe cómo temporalmente y de forma remota silenciar la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro mientras que los animales están involucrados en tareas de aprendizaje y memoria. El enfoque combina la farmacogenética (Diseñador-Receptores-exclusiva-Activado por Designer-Drogas) con un paradigma de comportamiento (precondicionamiento sensorial) que está diseñado para distinguir entre diferentes formas de aprendizaje. Específicamente, la entrega mediada por virus se utiliza para expresar un receptor de proteína G inhibitoria modificado genéticamente acoplado (el diseñador del receptor) en una región del cerebro discreta en el roedor. Tres semanas más tarde, cuando los niveles de expresión del receptor de diseñador son altos, un agente farmacológico (el diseñador de Drogas) se administra sistémicamente 30 min antes de una sesión de comportamiento específico. El fármaco tiene afinidad por el receptor diseñador y por lo tanto resulta en la inhibición de las neuronas que expresan el receptor diseñador, pero es de otra manera biológicamente inerte. La región del cerebro permanece silenciada durante 2-5 horas (Depending de la dosis y vía de administración). Al finalizar el paradigma de comportamiento, el tejido cerebral se evaluó para la colocación correcta y la expresión del receptor. Este enfoque es particularmente útil para determinar la contribución de las regiones cerebrales individuales a componentes específicos de comportamiento y puede ser utilizado a través de cualquier número de paradigmas de comportamiento.
Introduction
Un reto apasionante en el campo de la neurociencia conductual es determinar los sustratos neurales de comportamientos complejos. Un número de técnicas tales como lesiones permanentes, la inactivación cerebral temporal a través de cánulas e implantes optogenética se han empleado para identificar las contribuciones de regiones discretas del cerebro a subcomponentes de comportamientos complejos. Si bien estos enfoques informan a nuestra comprensión de la especificidad regional durante el aprendizaje, cada técnica no es sin limitaciones. Específicamente, las lesiones permanentes suelen realizarse antes de las pruebas de comportamiento, por lo tanto sus efectos están presentes durante toda la duración del paradigma. Estudios de canulación que implican la presentación de un inactivador neural a corto plazo (por ejemplo, la tetrodotoxina) puede producir un daño sustancial al tejido cerebral y pueden inducir estrés en sujetos justo antes de las pruebas de comportamiento. Además, la inactivación a través de la canulación se limita a la región de tejido que rodea lapunta de la cánula. Por último, mientras que la optogenética ofrece una gama de flexibilidad para el control temporal de la actividad en regiones específicas del cerebro, es un costo prohibitivo y técnicamente exigente.
Estas limitaciones pueden ser superadas mediante un enfoque de farmacogenética (diseño-Receptores-exclusiva-Activado por Diseñador-Drogas, DREADDs) 1,2. Es importante destacar que, mientras que el concepto de la farmacogenética es sofisticada, la ejecución de la técnica es sencilla. Similar a los métodos quirúrgicos estereotáxicas tradicionales que implican la infusión de la toxina (por ejemplo, NMDA, ácido iboténico) en regiones discretas del cerebro, esta técnica implica la infusión de un virus adeno-asociado (AAV) que contiene un fragmento de ADN para un receptor de proteína G inhibitoria modificado acoplado (hM4Di; el receptor de diseñador) en la región de interés de los roedores de laboratorio estándares (véase la Figura 1). El vector viral también contiene un indicador fluorescente (mcitrine). Una vez incorporado ena las células, el receptor de diseñador (y proteína indicadora) se expresan al máximo ~ 3 semanas después de la infusión y se pueden activar selectivamente para 2-5 hr por la administración sistémica de la droga de diseño de otra manera biológicamente inerte, clozapina-N-óxido (CNO) 1 , 3. Debido a que el experimentador está dotado de control temporal preciso, todavía remoto a través de la actividad neural en regiones específicas del cerebro, la farmacogenética combina particularmente bien con los paradigmas de comportamiento que se llevan a cabo en múltiples fases. En este ejemplo, la contribución de la corteza retroesplenial (RSC) al estímulo-estímulo de aprendizaje se compara con su papel en el aprendizaje pavloviano, sin embargo esta combinación de enfoques se adapta bien a cualquier número de preguntas que tratan de identificar la forma específica las regiones del cerebro contribuyen a comportamiento complejo.
Además, mientras que no se describe en el presente protocolo, los enfoques virales y transgénicos se pueden utilizar para lograr tipo de células específicas DREADD expresión 2. Como is inherente a paradigmas conductuales que implican tipos farmacológicos y / o de otro tipo de manipulaciones experimentales, una cuidadosa consideración de diseño experimental y el análisis cuantitativo posterior se requiere cuando se emplea el enfoque DREADD. Los experimentadores nuevos al enfoque DREADD se hace referencia a una revisión exhaustiva de la tecnología actual DREADD 2.
Cada día, los organismos aprenden acerca de nuevos estímulos y eventos y sus relaciones entre sí. Incluso en un ambiente familiar, tales como el hogar, uno es rápida para detectar alteraciones en las relaciones entre los estímulos debido a que estos cambios pueden ser predictivos de eventos significativos. Tal estímulo-estímulo (es decir, relacional) aprendizaje implica la conjunción de múltiples estímulos y tradicionalmente se ha asociado con el hipocampo, que reside centralmente dentro del lóbulo temporal medial 4. Sin embargo, no existe el hipocampo ni actuar de manera aislada; regiones corticales, tanto dentro como fueralado del lóbulo temporal medial proporcionar información sensorial crítica para la formación del hipocampo 5-7. Los estudios tradicionales de lesiones permanentes proporcionan evidencia convincente para la participación de un número de regiones corticales (por ejemplo, las cortezas retrosplenial, postrhinal y entorrinal) en el aprendizaje dependiente del hipocampo, pero están limitados en su capacidad de discernir el papel de una región en particular durante las fases discretas de aprendizaje 8-10.
El presente protocolo pone a prueba la hipótesis de que la RSC es necesaria para el aprendizaje estímulo-estímulo por silenciar a la RSC en una sola fase de un 3-fase paradigma precondicionamiento sensorial 11,12. Brevemente, las ratas reciben infusiones de un AAV que contiene el receptor diseñador y ~ 3 semanas más tarde se administró el fármaco de diseño (CNO) 30 min antes del inicio de las pruebas de comportamiento. En el presente protocolo, las ratas experimentales reciben CNO durante la primera fase de pruebas (cuando lear estímulo-estímuloción se produce) y reciben vehículo durante los próximos 2 fases de pruebas. Para controlar los efectos involuntarios de CNO en el comportamiento, infundir ratas con el receptor de diseñador (hM4Di) e inyectar con vehículo en lugar de CNO. Para tener en cuenta los efectos generales de infusión viral y la expresión del receptor, infundir un virus de control que no contiene el receptor de diseñador y administrar CNO.
Un número de diferentes serotipos de AAV se utilizan para entregar material genético. Las directrices actuales de los NIH para la investigación con recombinante o moléculas sintéticas que mantiene AAV (todos los serotipos) y constructos de AAV recombinantes o sintéticos, en la que el transgén no codifica ya sea un producto génico potencialmente tumorigénicos o una molécula de toxina y se producen en la ausencia de una virus auxiliar, requiere BSL-1 Precauciones (Grupo Apéndice B-1. Riesgo 1 (RG1) Agentes) 13. Un número de comentarios relativos a la estructura de AAV, utilidad y seguridad están disponibles 14,15. Cabe destacar que, aunque, Debido a las preocupaciones relativas a posibles 16,17 y potenciales mecanismos carcinogénicos reproductivos 18-20 en roedores, algunas instituciones requieren el uso de BSL-2 precauciones cuando se trabaja con AAV. Verifique la BSL apropiado antes de su uso mediante la consulta con los comités de supervisión de las instituciones individuales en los que la investigación se llevó a cabo, los Centros para el Control de Enfermedades y las directrices del NIH para investigaciones con ADN recombinante Moléculas 13 cuando se usan vectores virales para la manipulación de genes en los Estados Unidos. De protección personal, de formación investigadora, vector de contención, descontaminación, eliminación de materiales descontaminados, y después de la inyección de animales necesidades de vivienda son especificados por estas directrices. Además, consulte y siga apropiada Institucional Cuidado de Animales y utilizar las directrices del comité o directrices del comité de supervisión institucionales equivalentes para asegurar la manipulación, administración y disposición de AAV.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo se describe cómo aplicar un enfoque de farmacogenética (DREADD) para investigar cómo una región específica del cerebro contribuye a una tarea de aprendizaje compleja de múltiples fases. Con la capacidad de silenciar temporalmente y de forma remota la actividad neuronal en regiones discretas del cerebro a través de las fases de aprendizaje, esta combinación de enfoques ofrece una plataforma para investigar una amplia gama de comportamientos, incluyendo las formas más matizadas o enmascarados de ap…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los autores de Robinson et al. 12 por sus contribuciones al manuscrito del que se deriva parcialmente este protocolo.
Materials
| Male, Long Evans Rats, 55-60 d | Hilltop Lab Animals Inc | ||
| rAAV8/hSyn-HA-hM4D(Gi)-IRES-mCitrine | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| rAAV8/hSyn-GFP | Virus Vector Core | Caution: This is a BSL-1 compound | |
| Clozapine-N-Oxide | R&D Systems | 4936-10 | Designer Drug |
| Rat Cage lid (Polycarbonate) | Alternative Design | FT 8XL-PC | Used to cover animal cages 48-72 hours post infusion |
| Filer Paper (Replacement) | Alternative Design | FP-R-1018XAD | Filter paper that goes with cage lids |
| Table Top Vise | JETS | 2201-265 | For holding microscentrifuge tubes containing AAV in the hood |
| Medline Biohazard liners | Staples | 113444 | Biohazard Trash Bags |
| United Solutions 34 gallon rectangular wheeled trashcan with hook and lock handle | Amazon.com | Biohazard Trash Can | |
| Isoflurane, 100 mL | Patterson Veterinary Supply Inc. | 07-890-8540 | Anesthetic |
| Dual Small Animal Stereotaxic with Digital Display Readout Console | David Kopf | Model 942 | Surgical equipment |
| Non-rupture Ear Bars, set of 2 (Rat) | David Kopf | Model 955 | Surgical equipment |
| Anesthesia Mask (Rat) | David Kopf | Model 906 | Surgical equipment |
| High speed Stereotaxic drill includes table top motor controller, foot pedal, handpiece, stereotaxic handpiece holder | David Kopf | Model 1474 | Surgical equipment |
| Microdrill burrs, 0.9 mm | Fine Science Tools Inc | 19007-09 | Surgical supply |
| Automated Syringe pump with Micro4 Controller | David Kopf | Model UMP3-1 | Surgical equipment |
| Pro-animal detachable Ceramic Blade Clipper Kit | Ahdis | 21420 | Surgical supply |
| Betadine Skin Cleanser | Perdue Products L.P | 67618-149-04 | Surgical supply |
| Triple Antiobiotic Ointment | Medline Supply | 53329-087-01 | Surgical supply |
| Puralube Vet Ointment | Only Veterinary Supply | 17033-211-38 | Surgical supply |
| Dino-lite | Microscope | AD7013MTL | An alternative to the traditional disection scope |
| Dino-lite Rigid TableTop Boom Stand | Microscope | MS36B | Surgical equipment |
| 28 Gauge 10uL Syringe | Hamilton | 80308-701SN | Surgical equipment |
| Extra Tall MDF Sound attenuating Cubicle | Med Associates, Inc | ENV-018MD | 22'Wx22"Hx16"D |
| Extra Tall Modular Test Chamber | Med Associates, Inc | ENV-007 | Behavioral equipment |
| Stainless Steel Grid Floor | Med Associates, Inc | ENV-005 | Behavioral equipment |
| House Light | Med Associates, Inc | ENV-215M | Used as the house light and stimulus light |
| Modular Pellet Dispenser | Med Associates, Inc | ENV-203M-45 | Behavioral equipment |
| Pellet Recetacle, Cup Type | Med Associates, Inc | ENV-200R1M | Behavioral equipment |
| Head Entry Detector for Rat | Med Associates, Inc | ENV-254-CB | Behavioral equipment |
| Dustless precision food pellets, 45 mg | Bio-Serv | F0165 | Behavioral supply |
| Cage Speaker for Rat Chamber | Med Associates, Inc | ENV-224AM | Behavioral equipment |
| Programmable Audio Generator | Med Associates, Inc | ANL-926 | Behavioral equipment |
| Smart Ctrl 8 Input/16 output Package | Med Associates, Inc | DIG-716P2 | Behavioral equipment |
| Large Table Top Cabinet and Power Supply | Med Associates, Inc | SG-6510D | Behavioral equipment |
| PCI Interface Package | Med Associates, Inc | DIG-700P2-R2 | Behavioral equipment |
| MED Intel core Computer Pkg with X Pro 19" Monitor | Med Associates, Inc | COM-103V | Behavioral equipment |
| Paraformaldehyde (grannular), 1 kg | Electron Microsopy Sciences | 19210 | Hazard: carcinogen, weigh in hood |
| Rabbit Monoclonal antibody (HA-Tag) | Cell Signaling Technologies | 3724S | Histology reagent |
| XP Rabbit monoclonal antibody (GFP) | Cell Signaling Technologies | 2956S | Histology reagent |
| Anti-Rabbit IgG | Cell Signaling Technologies | 4412S | Histology supplies |
| Superfrost Plus slides | VWR international | 483111-703 | Histology supplies |
References
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