Ex Vivo Kultur Faryngeal Arches at studere hjerte og Muskel Progenitorer og deres niche

Summary

Here, we present a protocol to culture pharyngeal arches to study the biology of heart and muscle progenitor cells and their microenvironment.

Abstract

Svælg mesoderm udviklingslandenes embryoner bidrager til brede områder af hoved og hjerte muskulatur. Vi har udviklet en ny metode til at studere hoved og hjerte progenitorcelle udvikling med svælg buer (også kendt som Branchialfodderne buer) ex vivo. Under anvendelse af denne metode har vi for nylig beskrevet, at den anden svælg arch indeholder selvfornyende hjerte progenitorer og tjener som et mikromiljø til ekspansion af stamceller under muse hjerte udvikling. Progenitorcellerne forbliver udifferentieret og ekspansiv inde i buen, men hurtigt bliver funktionelle cardiomyocytter, når de trækker ud af buen. Vi rapporterede også, at første svælg arch indeholder muskel stamfædre giver anledning til myotuber efter at have forladt buen. Her viser vi proceduren for dissektion og ex vivo kultur af første og anden svælg buer fra udviklingen museembryoer. Metoden gør det muligt at studere hoved og hjerte stamfader / muskel development, herunder cardiomyocyte og myotube dannelse i detaljer ex vivo.

Introduction

Svælg mesoderm celler giver anledning til dele af hjertet og svælg muskler. Under fosterudviklingen, multipotente kardiale progenitorceller fra den anden hjerte felt migrere fra svælg mesoderm og befolke hjertets udstrømning tarmkanalen og højre ventrikel, og deres unormal udvikling er tæt forbundet med medfødt hjertesygdom-den førende årsag til fosterskader og fødsel defect- relaterede dødsfald hos mennesker ^1-3. Nylige undersøgelser har vist, at pharyngeal mesoderm bidrager til hovedet muskler, udover hjertet, hvilket gør mesoderm en kritisk del af cardio-kraniofacial udvikling ^4. Således er de udviklingsmæssige processer, herunder induktion, proliferation og differentiering af hoved og hjerte progenitorer i svælg mesoderm er under aktiv efterforskning ^5-7.

Indtil for nylig, forblev ukendt, om hjerte-stamceller undergår ekspansion without differentiering, dels på grund af manglende oplysninger om deres cellulære miljø. Vores seneste undersøgelse tyder på, at svælg buer tjene som mikromiljø til fornyelse af hjerte- og muskel stamfædre og kan dyrkes ex vivo over flere uger ^8. Denne eksplantat metode giver et hidtil ukendt og enestående mulighed for at undersøge udviklingen af hjerte-kraniofaciale progenitorer ex vivo.

Protocol

Alle mus blev holdt på et American Association for akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC) -accredited dyr facilitet på Johns Hopkins University og har til huse i overensstemmelse med de procedurer, der er skitseret i Vejledning for pleje og anvendelse af forsøgsdyr. Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) godkendte alle forsøgsprotokoller. 1. Eksperimentel Forberedelse Coat 12-brønds plade med 10% føtalt bovint serum (FBS) i phosphatbufret opløsning (PBS) i 60 minutter. …

Representative Results

Under udvikling, kan ansigts muskler og hjerte stamfædre spores, da de formerer og migrere fra 1. og 2. svælg bue, til at blive hoved og hjerte muskulatur, henholdsvis (figur 1A, A 'og A' '). Dyrkning svælg buer tilbyder en unik måde at studere hjerte og muskel udvikling i detaljer ex vivo. Efter dissektion og fastgørelse af svælg buer, kan migrerer celler fra vedhæftede buer observeres inden for 24-48 timer af kultur. Inden for 3 dage k…

Discussion

I denne video viser vi, hvordan man isolere og kultur første og anden svælg buer af 9,5 dage gamle museembryoer. Svælg buer er forbigående, segmenteret buler, der vises på craniolateral side af udviklingslandene embryoner ^9, som indeholder flere potente hjerte-stamceller-byggesten til at gøre hjertet under embryogenese ^10,11 -I anden buer og hoved muskel stamfædre i første buer ⁸ .

Dissektion af svælg buer kræver avancerede mus embryo dissektion fæ…

Materials

FBS	Hyclone	SH30071.03
PBS + Ca2 + Mg2	Corning	21-030-CV
10cm petri plates	Fishersci	FB0875712
Scissor
Dissection forceps
Serum Free Media:
IMDM	Cellgro	15-016-CV
Ham’s F12	Cellgro	10-080-CV
N2-SUPPLEMENT	Gibco	17502-048
B27-retinoic acid	Gibco	12587-010
10% BSA (in PBS) à (Invitrogen Cat#. P2489)	Life Sciences	P2489
100X Glutamine (Gibco Cat.# 25030-081)	Gibco	35050-61
100X Pen/Strep (Gibco Cat#. 15070-063)	Gibco	15140-122