Criação e Caracterização da UTI e CAUTI em um modelo de rato

Summary

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

Infecções do trato urinário (ITU) são altamente prevalentes, uma importante causa de morbidade e estão cada vez mais resistente ao tratamento com antibióticos. As fêmeas são desproporcionalmente afetados por UTI: 50% de todas as mulheres terão uma infecção urinária em sua vida. Além disso, 20-40% dessas mulheres que têm uma inicial UTI vai sofrer uma recorrência com algumas recorrências freqüentes que sofrem com grave deterioração da qualidade de vida, dor e desconforto, a interrupção das atividades diárias, aumento dos custos de cuidados de saúde, e poucas opções de tratamento outro de profilaxia antibiótica de longo prazo. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) é o principal agente causador da adquirida na comunidade ITU. Associada a cateter ITU (ITU-SVD) é a infecção hospitalar adquirida mais comum responsável por um milhão de ocorrências em os EUA anualmente e custos dramáticos de saúde. Enquanto UPEC é também a principal causa de CAUTI, outros agentes causadores são da maior importância, incluindo Enterococcusfaecalis. Aqui nós utilizamos dois modelos de ratos bem estabelecidas que recapitulam muitas das características clínicas destas doenças humanas. Para UTI, um modelo C3H / HeN recapitula muitas das características de virulência UPEC observados em seres humanos, incluindo respostas de acolhimento, formação IBC e filamentação. Para CAUTI, utilizando um modelo de murganhos C57BL / 6, que retém o implante na bexiga cateter, tem sido mostrado para ser susceptível a E. faecalis infecção da bexiga. Estes modelos representativos estão sendo usados ​​para ganhar novos insights marcantes na patogênese da doença de UTI, que está levando ao desenvolvimento de novas terapias e estratégias de gestão ou de prevenção.

Introduction

Infecções do trato urinário (ITU) é uma das infecções bacterianas mais comuns e podem ser divididos em duas categorias com base no mecanismo de aquisição, comunidade e hospitalar adquirida UTI. UTIs geralmente ocorrem em mulheres saudáveis ​​e estudos adquirida na comunidade mostraram que aproximadamente 50% das mulheres terão pelo menos uma UTI em sua vida ^1. Além disso, a recorrência é um grande problema. Uma mulher que tem uma infecção aguda inicial tem uma chance de 25-40% de ter uma segunda infecção no prazo de seis meses, apesar adequado tratamento antibiótico e muitas mulheres continuam a ter recorrências freqüentes ^2. As bactérias que causam estas infecções também estão se tornando cada vez mais resistentes aos antibióticos mais protocolos de tratamento de confusão ^3-6. UTI afetam milhões de pessoas a cada ano custando cerca de 2,5 bilhões de dólares em despesas relacionadas com cuidados de saúde em os EUA, ressaltando o impacto ea prevalência da doença1,7 .Nosocomial adquirida UTIs estão principalmente associados com a presença de corpos estranhos, tais como cateteres. Associada a cateter UTIs (CAUTI) continuam a ser os nosocomial mais comum adquirida UTI, representando ~ 70-80% de tais infecções ^8. Além disso, CAUTI está associada com aumento da morbidade e mortalidade e é a causa mais comum de infecções da corrente sanguínea secundárias ^9.

Comunidade associada UPEC adquirida UTIs são pensados ​​para ser causada pela introdução de bactérias na bexiga de reservatórios no trato gastrointestinal através de manipulação mecânica durante a relação sexual, falta de higiene ou outras dinâmicas população microbiana entre host diferente nichos ^10. Uma vez no interior da bexiga, UPEC empregar vários factores de virulência, incluindo cápsulas, sistemas de aquisição de ferro, toxinas, um plasmídeo de virulência, ARNt, ilhas de patogenicidade e fatores de colonização que foram mostrados para desempenhar um papel na patogénese <sup> 11-14. Fundamental para o estabelecimento de colonização UPEC, UPEC também codificar vários tipos de acompanhante adesiva arrumador via (CUP) pili que reconhecem receptores com especificidade estereoquimica ^15. Tipo 1 pili, inclinado e com a adesina FimH, são expressos por UPEC e se ligam uroplakins ¹⁶ e α-1, β-3 integrinas ^17, que são expressos na superfície luminal dos dois bexigas humanas e mouse ¹⁸ mannosylated. Estas interacções mediadas por FimH facilitar a colonização bacteriana e invasão das células epiteliais superficiais ^19,20. Uma vez dentro da célula, UPEC pode escapar para dentro do citoplasma onde uma única bactéria pode dividir-se rapidamente para formar uma comunidade bacteriana intracelular (IBC), o qual após a maturação, pode conter 10 ~ ^{4 21} bactérias. Formação IBC tem sido demonstrada em, pelo menos, seis estirpes diferentes de rato, C3H / HeN, C3H / HeJ, ratinhos C57BL / 6, CBA, FVB / NJ e BALB / C, e com uma grande variedade de diferentes UPEEstirpes C e outras Enterobacteriaceae ^22-24. No entanto diferenças temporais e espaciais da formação IBC pode variar, dependendo do fundo do rato e a estirpe infectante UPEC. Em ratinhos C3H / HeN infectadas com o UPEC protótipo estirpes UTI89 ou formação CFT073, IBC pode ser visualizada como pequenos biomassas de bactérias tão cedo quanto 3 hpi (infecção hr post). Esta comunidade continua a expandir-se e atinge um "ponto médio" de desenvolvimento de aproximadamente 6 hpi, quando a bactéria em forma de haste ocupam uma grande percentagem do espaço citoplasmático de células guarda-chuva superficial terminalmente diferenciadas Estes GRG forma precoce de uma maneira relativamente síncrona com a maioria visualizadas dimensões similares e morfologias. ~ 8 hpi as bactérias no IBC mudança a partir de um bacilo cocos morfologia. GRG são de natureza transitória. Assim, a maturação IBC 12-18 resultados HPI em contínua expansão da população bacteriana, seguido do seu filamentação e dispersão para fora da célula with propagação subsequente às células vizinhas ^23. Assim, o nicho IBC permite rápido crescimento bacteriano num ambiente protegido da resposta imune do hospedeiro e antibióticos ^25. As fases distintas de infecção UPEC que são vistas em ratos também são observadas em seres humanos, tais como os GRG e filamentação, suportando o modelo de ratinho de ITU como uma ferramenta útil que pode ser usado para modelar ITU em seres humanos ^22,26-28.

Enquanto a maioria das mulheres experimentam uma infecção urinária em sua vida, o resultado dessas infecções podem variar de infecção aguda auto-limitada sem o retorno, a cistite recorrente frequente. Além disso, estudos têm mostrado uma forte ocorrência familiar de UTI, sugerindo um componente genético contribui para a UTI susceptibilidade ^29. Descobrimos que os resultados divergentes UTI atendidos em clínicas pode ser espelhado pelos resultados diferentes de infecção experimental UPEC entre linhagens puras ^30. Por exemplo, C3H / galinha, CBA, Ratinhos DBA, e C3H / HeOuJ são susceptíveis, de uma forma dependente da dose infecciosa, a cistite longa duração, crónica, caracterizada por as bactérias persistentes de título elevado (> 10 ⁴ unidades formadoras de colónias (CFU) / ml), bacterianas título elevado fardos de bexiga em sacrifício> 4 semanas pós-infecção (WPI), inflamação crônica e necrose urothelial. Estes ratos também apresentam níveis séricos elevados de IL-6, FEC-G, KC e IL-5 nas primeiras 24 hpi que servem como biomarcadores para o desenvolvimento de cistite crónica. Isso pode representar fielmente o curso natural da UTI em algumas mulheres, como estudos placebo mostraram que uma grande percentagem de mulheres que experimentam UTI manterá altos níveis de bactérias em sua urina por várias semanas após os primeiros sintomas da cistite se não for dado o tratamento com antibióticos ^{31 , de 32 anos.} Além disso, usando ratinhos C3H / galinha, descobrimos que uma história de cistite crônica é um fator de risco significativo para infecções recorrentes subseqüentes graves. ITU recorrente é o mais simanifestação clínica gnificant de UTI eo rato C3H / HeN é atualmente o modelo estudado apenas que recapitula uma maior predisposição após a exposição anterior. Um segundo resultado UTI é recapitulada em camundongos C57BL / 6, onde a infecção aguda UPEC é auto-limitada, com resolução de inflamação da bexiga e bacteriúria dentro de aproximadamente uma semana. Interessantemente, no presente modelo, UPEC prontamente formar reservatórios intracelulares quiescentes dentro do tecido da bexiga do que UPEC são capazes de sair de um estado latente para reiniciar uma ITU activo, potencialmente explicando um mecanismo para a mesma estirpe ITU recorrente em seres humanos ^{33, 34.}

Além de influências genéticas em ITU susceptibilidade, a introdução de um cateter na bexiga aumenta grandemente a probabilidade de ter uma infecção, assim como o aumento da gama de bactérias capazes de causar uma infecção. Tem sido demonstrado que a cateterização urinária humana provoca histológica ealterações imunológicas na bexiga devido ao stress mecânico que resulta em uma resposta inflamatória robusta, esfoliação, edema da lâmina e submucusa, desbaste urotelial, e lesão da mucosa do urotélio e rim ^35,36. Além disso, o cateter proporciona uma superfície para a fixação bacteriana criando assim um ambiente utilizado por várias espécies de causar CAUTI. Enquanto UPEC ainda são um dos principais contribuintes, Enterococcus faecalis é responsável por 15% destes CAUTI ^37. E. faecalis está se tornando cada vez mais resistentes aos antibióticos com vancomicina surgimento de resistência, o que representa um grave problema de saúde ^38. E. faecalis possuem inúmeros fatores de virulência, incluindo toxinas e adesinas necessárias para fixação em ambos o cateter e epitélio ^38. Durante a sondagem vesical, o anfitrião é vulnerável a adesão microbiana, a multiplicação ea disseminação no ^39,40 trato urinário. E. Faecalis forma um biofilme sobre o cateter como parte de um mecanismo de persistir na bexiga e divulgar para os rins, que é reproduzida em um modelo de rato CAUTI ^41. Recentemente, tem sido demonstrado durante a cateterização urinária, o fibrinogénio (Fg) é libertado para dentro da bexiga, como parte da resposta inflamatória. Fg acumula na bexiga, reveste o cateter e é essencial para E. faecalis formação de biofilme, funcionando como um andaime anexo. Em um modelo de murganhos C57BL / 6 de rato CAUTI, descobrimos que a E. a formação de biofilme faecalis no cateter, e, assim, a persistência na bexiga, foi dependente do pilus Ebp, especificamente o seu EBPa de adesina de extremidade. Verificou-se que o domínio N-terminal de EBPa se liga especificamente a FG revestimento do cateter. Além disso, verificou-se que a E. faecalis utiliza Fg como fonte de metabólitos durante a infecção, aumentando assim a formação de biofilme ^42.

Modelos de ratos têm provado crítica para undersensão, bem como prever manifestações clínicas da UTI e CAUTI ^41. Neste artigo vamos demonstrar preparo do inóculo da cistite UPEC isolar UTI89 e inoculação transuretral de camundongos C3H / galinha. Adicionalmente, demonstramos um protocolo para a inserção do cateter na ratinhos C57BL / 6 e inoculação da E. faecalis OG1RF tensão. Ambas as técnicas para levar consistente e fiável ITU ou CAUTI em ratinhos. Nós também exibem técnicas usadas para observar a formação IBC durante cistite aguda e coleta de urina para análise de cistite crônica ou recorrente. Camundongos C3H / HeN têm sido utilizados para estudar aspectos da UPEC patogênese bacteriana incluindo invasão inicial, formação IBC, filamentação eo desenvolvimento de cistite crônica ^23,33,43. Estes parâmetros de virulência também têm sido estudadas em uma variedade de outras origens rato ^22,33. Para CAUTI, o / 6 modelo C57BL permite a implantação de corpo estranho na bexiga com co bacteriana subseqüenteIonização, que pode ser mantido durante 7 dias após a infecção ^{de 41.} Estes modelos têm sido úteis para avaliar mecanismos de virulência bacteriana, respostas do hospedeiro à UTI e mecanismos para subverter a resposta do hospedeiro, muito do que foi posteriormente retomados ou observados em populações humanas clínicos.

Protocol

Declaração de Ética: A Comissão de Estudos animal da Universidade de Washington aprovou todas as infecções e procedimentos de mouse, como parte do protocolo número 20120216, o qual foi aprovado 2013/01/11 e 2016/01/11 expira. Cuidado geral dos animais foi consistente com a guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Conselho Nacional de Pesquisa e Guia de Recursos de Cuidados USDA Animal. Procedimentos de eutanásia são consistentes com as "orientações AVMA para a eutanásia dos animais ediç?…

Representative Results

Os modelos intravesicais de simples e cateter UTI associado fornecer plataformas flexíveis para elucidar os mecanismos moleculares da patogênese bacteriana, o impacto destas doenças no tecido hospedeiro, e o desenvolvimento e teste de novas abordagens para gerenciar essas infecções comuns e dispendiosas. Dependendo da estirpe de ratinho e de agentes patogénicos, a inoculação intravesical pode ser utilizado para estudar interacções hospedeiro-agente patogénico para elucidar factores necessários para iniciar o…

Discussion

Comunidade descomplicada adquirida UTI é ​​uma infecção comum e onerosa respondendo por vários milhões de atendimentos ambulatoriais por ano ^46. Além disso, Cautis são uma infecção adquirida saúde comum que tornou-se extremamente onerosa para os profissionais de saúde como os Centros de Serviços Medicare e Medicaid não reembolsa os prestadores para o custo adicional de tratamento resultante do hospital adquiriu CAUTI ^45. Os modelos de ratinho de infecção do trato urinário, cisti…

Materials

Material for catheter and needle preparation:
30ga needles	BD Precision Glide	305106	30Gx ½ (0.3 mm x 13mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 mL
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs – Stainless Steel – Large Capacity –
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 in
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 in x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1X Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299