Создание и характеристика ИМП и CAUTI в мышиной модели

Summary

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) широко распространены, существенной причиной заболеваемости и более устойчивы к лечению антибиотиками. Женщины непропорционально страдают от ИМП: 50% всех женщин будут иметь ИМП в течение своей жизни. Кроме того, 20-40% из этих женщин, которые имеют начальное ИМП будет страдать повторения с некоторыми страдающих частыми рецидивами с серьезным ухудшением качества жизни, боль и дискомфорт, нарушение повседневной деятельности, увеличение расходов на здравоохранение, и несколько вариантов лечения другой чем долгосрочные антибиотикопрофилактики. Уропатогенные кишечная палочка (УПЭК) является основным возбудителем внебольничной ИМП. Катетер-ассоциированные ИМП (CAUTI) является наиболее распространенным больница приобрела инфекции приходится на миллион вхождений в США ежегодно и драматических расходов на здравоохранение. В то время как УПЭК также основной причиной CAUTI, другие возбудители имеют более важное значение в том числе Enterococcusфекальный. Здесь мы используем два устоявшихся моделей мыши, что повторять многие из клинических характеристик этих заболеваний человека. Для ИМП, модель С3Н / HeN повторяет многие из особенностей УПЭК вирулентности наблюдаемых у человека в том числе ответов хозяев, формирования IBC и филаментацию. Для CAUTI, модели с использованием мышей C57BL / 6, которые сохраняют имплантаты мочевого пузыря катетер, было показано, что быть чувствительны к E. фекальный инфекции мочевого пузыря. Эти представительные модели, которые используются для получения ярких новых идей в патогенезе заболевания ИМП, которая ведет к развитию новых терапевтических стратегий и управления или профилактики.

Introduction

Инфекции мочевыводящих путей (ИМП) являются одним из самых распространенных бактериальных инфекций и может быть разделен на две категории в зависимости от механизма приобретения, сообщества и нозокомиальных ИМП приобретенной. Внебольничная ИМП часто встречаются в противном случае здоровых женщин и исследований показали, что примерно 50% женщин будут иметь по крайней мере один ИМП в течение своей жизни ^1. Кроме того, рецидивы серьезной проблемой. Женщина, которая имеет начальную острую инфекцию имеет 25-40% шансов родить второй инфекции в течение шести месяцев, несмотря на соответствующее лечение антибиотиками и многие женщины по-прежнему имеют частые рецидивы ² в. Бактерии, которые вызывают эти инфекции также становится все более устойчивых к антибиотикам дальнейшие смешанные протоколы лечения ^3-6. ИМП влияет миллионы людей каждый год обходится примерно 2,5 млрд долларов в области здравоохранения, связанных расходов в США, подчеркивает влияние и распространенность заболевания1,7 .Nosocomial приобрела ИМП, в основном, связано с наличием инородных тел, таких как постоянных катетеров. Катетер-ассоциированные ИМП (CAUTI) остаются наиболее распространенным внутрибольничной приобрела ИМП, что составляет ~ 70-80% таких инфекций ^8. Кроме того, CAUTI связано с увеличением заболеваемости и смертности, и это наиболее частая причина вторичного инфекций кровотока ^9.

УПЭК связано внебольничная ИМП думал быть вызвано введением бактерий в мочевой пузырь из водохранилищ в желудочно-кишечном тракте через механических манипуляций во время полового акта, плохой гигиены или других микробных динамики населения между другом хосте ниши ^10. После того, как в пузыре, УПЭК использовать многочисленные факторы вирулентности, в том числе капсулы, систем сбора железа, токсинов, в плазмиды вирулентности, тРНК, патогенности островов и колонизации факторов, которые, как было показано, играют роль в патогенезе <SUP> 11-14. Важнейшее значение для установления УПЭК колонизации, УПЭК также кодировать различные типы клея шаперонной ассистента путь (CUP) пили, которые распознают рецепторы с стереохимического специфики ^15. Тип 1 пили, с наконечниками адгезина FimH, выражаются УПЭК и связывать mannosylated uroplakins ¹⁶ и α-1, β-3 интегрины ^17, которые выражаются на поверхности просвета обоих человеческих и мышиных пузырей ^18. Эти FimH-опосредованной взаимодействия облегчить бактериальной колонизации и инвазии поверхностных эпителиальных клеток ^19,20. После того, как в клетке, УПЭК может избежать в цитоплазму, где одна бактерия может быстро разделить, чтобы сформировать внутриклеточный бактериальный сообщества (IBC), который при созревании, может содержать ~ 10 ⁴ бактерий ^21. Формирование МДС была продемонстрирована по крайней мере шесть различных линий мышей, С3Н / курица, С3Н / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ и BALB / C, так и с широким спектром различных UPEШтаммы C и других энтеробактерий ^22-24. Однако временные и пространственные различия формирования IBC может изменяться в зависимости от фона мыши и заражение штаммом UPEC. В C3H / HeN мышей, инфицированных штаммами прототипа УПЭК UTI89 или образование CFT073, МКБ могут быть визуализированы в виде небольших биомасс бактерий в начале 3 HPI (после инфекции ч). Это сообщество продолжает расширяться и достигнет "среднюю" развития приблизительно 6 HPI когда стержнеобразные бактерии занимают большой процент цитоплазматической пространства неизлечимо дифференцированных поверхностные клетки зонтик Эти ранние формы КСГМГ в относительно синхронно с большинством отображаются аналогичные размеры и морфологии. ~ 8 HPI бактерии в изменении IBC от бацилл в кокки морфологию. КСГМГ преходящий характер. Таким образом, МКБ созревания 12-18 HPI результатов в дальнейшее расширение бактериальной популяции, с последующим их филаментации и разгона из клеток Wiго последующее распространение на соседние клетки ^23. Таким образом, ниша МКБ позволяет быстро бактериального роста в среде, защищенной от иммунной реакции и антибиотики ^25. Отличительные этапы UPEC инфекции, которые видны у мышей наблюдались также у людей, таких как КСМ и филаментацию, поддерживая модель мыши ИМП как полезный инструмент, который можно использовать для моделирования ИМП у людей ^22,26-28.

В то время как большинство женщин испытывают ИМП в течение своей жизни, исход этих инфекций может варьироваться от острой самоограничения инфекции не рецидива, частым рецидивирующим циститом. Кроме того, исследования показали сильную семейной возникновение ИМП, предполагая, генетический компонент способствует ИМП восприимчивости ^29. Мы обнаружили, что различные УТИ результаты видны в клиниках может быть зеркальным по различающихся результатов экспериментальной УПЭК-инфекции среди инбредных линий мышей ^30. Например, С3Н / курица, ЦБМышей DBA, и С3Н / HeOuJ подвержены, в инфекционном дозозависимо, чтобы длительной, хронический цистит характеризуется стойким, высокие бактерий титр (> 10 ⁴ колониеобразующих единиц (КОЕ) / мл), высокий титр бактерий бремя пузыря в жертву> 4 недели после заражения (WPI), хроническое воспаление, некроз и уротелиальная. Эти мыши также отображать повышенные сывороточные уровни IL-6, G-CSF, КЦ, и IL-5 в течение первых 24 HPI, которые служат в качестве биомаркеров для развития хронического цистита. Это может точно представлять естественный ход ИМП у некоторых женщин, как показали исследования плацебо показали, что большой процент женщин, испытывающих ИМП сохранит высокие уровни бактерий в моче в течение нескольких недель после появления первых симптомов цистита, если не назначено лечение антибиотиками ^{31 , 32.} Кроме того, с помощью С3Н / Курица мышей, мы обнаружили, что история хронического цистита является существенным фактором риска для последующих тяжелых рецидивирующих инфекций. Периодические ИМП наиболее сиgnificant клиническим проявлением ИМП и С3Н / Курица мыши в настоящее время только учился модель повторяет повышенный предрасположенность после предыдущего воздействия. Второй исход ИМП обобщено мышей C57BL / 6, где острой инфекции УПЭК самоограничивает, с разрешением воспаления мочевого пузыря и бактериурию в течение примерно недели. Интересно, что в этой модели, УПЭК легко образуют покоящиеся внутриклеточные резервуары в ткани мочевого пузыря, из которого УПЭК способны выходит из состоянии покоя, чтобы возобновить активное ИМП, потенциально пояснения одного механизма же штамма рецидивирующей ИМП у человека ^{33, 34.}

В дополнение к генетических факторов, влияющих на УИП восприимчивости, введение катетера в мочевой пузырь значительно увеличивает вероятность наличия инфекции, а также расширение спектра бактерий, способных вызвать инфекцию. Было показано, что катетеризация мочевого пузыря человек вызывает гистологические ииммунологические изменения в мочевом пузыре из-за механического напряжения, что приводит к прочной воспалительной реакции, пилинга, отек собственной пластинки и submucusa, мочевых путей и истончение слизистой поражением почек и уротелии ^35,36. Кроме того, катетер обеспечивает поверхность для прикрепления бактерий, тем самым создавая среду, используемую несколькими видами, чтобы вызвать CAUTI. В то время как все еще ​​УПЭК из основных причин, Enterococcus фекальный составляет 15% от этих ³⁷ CAUTI. Е. фекальный становится все более устойчивыми к антибиотикам ванкомицин сопротивления появление, создавая серьезную озабоченность здоровья ^38. Е. фекальный обладают многочисленные факторы вирулентности, включая токсины и адгезинов, необходимых для присоединения к так катетера и эпителия ^38. Во время катетеризации мочевого, хозяин уязвимыми для микробов адгезии, размножения и распространения в ^39,40 мочевыводящих путей. Е. faecaЛис образует биопленку на катетере, как часть механизма сохраняются в мочевом пузыре и распространять почек, которая приводится в мыши CAUTI модели ^41. Недавно было показано, во мочевого катетера, фибриногена (Fg) поступает в мочевой пузырь, как часть воспалительной реакции. Fg накапливается в мочевом пузыре, пальто катетера и имеет важное значение для E. фекальный образование биопленки, функционирует в качестве эшафот вложения. В модели мышей C57BL / 6 мышей CAUTI, мы обнаружили, что Е. формирование биопленки фекальный на катетер, и, таким образом, сохранение в мочевом пузыре, зависит от пилуса EBP, в частности, ее кончик адгезин EbpA. Мы обнаружили, что N-концевой домен EbpA специфически связывается с FG покрытия катетер. Кроме того, было установлено, что Е. фекальный использует Fg в качестве источника инфекции во время метаболита, таким образом, увеличивая образование биопленки ^42.

Мышиные модели доказали решающее значение для Understanding а также прогнозирования клинических проявлений ИМП и CAUTI ^41. В этой статье мы покажем, подготовку посевной в цистита УПЭК изолировать UTI89 и трансуретральная прививку С3Н / HeN мышей. Кроме того, мы продемонстрировать протокол для катетера в C57BL / 6 мышей и инокуляции Е. фекальный OG1RF штамм. Оба из этих методов приводит к последовательной и надежной ИМП или CAUTI у мышей. Мы также отображать методы, используемые для наблюдения образование IBC во время острого цистита и сбора мочи для анализа хронического рецидивирующего цистита или. С3Н / HeN мышей были использованы для изучения аспектов патогенеза УПЭК в том числе начального бактериальной инвазии, формирования IBC, филаментации и развития хронического цистита ^23,33,43. Эти параметры вирулентности также были изучены в различных других слоев мыши ^22,33. Для CAUTI, C57BL / 6 модель позволяет иностранным имплантации тела в мочевой пузырь с последующим бактериальной сотрудничестваионизация, которая может поддерживаться в течение 7 дней после заражения ^41. Эти модели были полезны для оценки механизмов бактериальной вирулентности, принимающих ответов на ИМП и механизмы, чтобы ниспровергать ответов хозяев, большая часть которых была впоследствии воспроизводятся или наблюдаемые в клинических популяциях человека.

Protocol

Заявление по этике: Университет Комитет животных Исследования Вашингтон одобрил все инфекции мыши и процедуры как часть протокола числа 20120216, который был одобрен 01/11/2013, истекает 01/11/2016. В целом уход за животными согласуется с гидом по уходу и использованию лабораторных животных от Рук?…

Representative Results

Внутрипузырное модели неосложненных и катетера, связанной ИМП обеспечивают гибкие платформы для выяснения молекулярных механизмов патогенеза бактериальной, влияние этих заболеваний на ткани хозяина, а также разработки и испытания новых подходов в управлении этих общих и дорогостоя…

Discussion

Несложный внебольничная ИМП общей и дорогостоящей инфекции составляет несколько миллионов посещений ПМСП каждый ⁴⁶ год. Кроме того, Cautis являются общим здравоохранения приобрели инфекция, которая не стала чрезвычайно дорого медицинских работников как центры Medicare и Medicaid Services бол?…

Materials

Material for catheter and needle preparation:
30ga needles	BD Precision Glide	305106	30Gx ½ (0.3 mm x 13mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 mL
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs – Stainless Steel – Large Capacity –
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 in
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 in x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1X Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299