Establecimiento y caracterización de IU y ITUAC en un modelo de ratón

Summary

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

Infecciones del tracto urinario (ITU) son altamente prevalentes, una causa importante de morbilidad y son cada vez más resistentes al tratamiento con antibióticos. Las mujeres se ven desproporcionadamente afectados por la UTI: 50% de todas las mujeres tendrán una infección urinaria en su vida. Además, el 20-40% de estas mujeres que tienen una inicial UTI sufrirá una recurrencia con algunas recurrencias frecuentes que sufren con grave deterioro en la calidad de vida, el dolor y el malestar, la interrupción de las actividades diarias, el aumento de los costes sanitarios, y pocas opciones de tratamiento otra que la profilaxis antibiótica a largo plazo. Uropatógena Escherichia coli (UPEC) es el agente causal principal de la UTI adquirida en la comunidad. IU asociada al catéter (ITUAC) es el hospital infección adquirida más común que representa un millón de ocurrencias en los EE.UU. cada año y los costes sanitarios dramáticos. Mientras UPEC es también la principal causa de infección urinaria, otros agentes causantes son de una mayor importancia incluyendo Enterococcusfaecalis. Aquí utilizamos dos modelos bien establecidos de ratón que recapitular muchas de las características clínicas de estas enfermedades humanas. Para IU, un modelo C3H / HeN recapitula muchas de las características de la UPEC virulencia observadas en los seres humanos, incluyendo las respuestas de acogida, formación de IBC y filamentation. Para ITUAC, un modelo utilizando ratones C57BL / 6, que retienen los implantes de catéter de la vejiga, se ha demostrado ser susceptibles a E. faecalis infección de la vejiga. Estos modelos representativos se están utilizando para obtener nuevos conocimientos sorprendentes sobre la patogénesis de la enfermedad de IU, que está llevando al desarrollo de nuevas terapias y estrategias de gestión o de prevención.

Introduction

Infecciones del tracto urinario (ITU) son una de las infecciones bacterianas más comunes y se pueden dividir en dos categorías basadas en el mecanismo de la adquisición, la comunidad y nosocomial adquirida UTI. Infecciones urinarias a menudo ocurren en mujeres y estudios por lo demás sanos adquirida en la comunidad han demostrado que aproximadamente el 50% de las mujeres tendrán al menos una infección urinaria en su vida ^1. Además, la recurrencia es un problema importante. Una mujer que tiene una infección aguda inicial Ocasión 25-40% de tener una segunda infección dentro de los seis meses a pesar del tratamiento antibiótico adecuado y muchas mujeres siguen teniendo recurrencias frecuentes ^2. Las bacterias que causan estas infecciones son cada vez más los protocolos de tratamiento cada vez más resistentes a los antibióticos de confusión ^3-6. IU afecta a millones de personas cada año cuesta aproximadamente 2,5 millones de dólares en gastos relacionados con el cuidado de la salud en los EE.UU., lo que subraya el impacto y la prevalencia de la enfermedad1,7 .Nosocomial adquirió las ITU se asocian principalmente con la presencia de cuerpos extraños tales como catéteres permanentes. Infecciones urinarias asociadas a catéter (ITUAC) siguen siendo los nosocomial más común adquirida IU, lo que representa ~ 70-80% de estas infecciones ^8. Además, ITUAC se asocia con aumento de la morbilidad y la mortalidad y es la causa más común de infecciones del torrente sanguíneo secundarias ^9.

UPEC comunidad asociada adquirida UTI se cree que es causada por la introducción de bacterias en la vejiga de los embalses en el tracto gastrointestinal a través de la manipulación mecánica durante la relación sexual, la falta de higiene u otras dinámicas de población microbiana entre los diferentes nichos de acogida ^10. Una vez dentro de la vejiga, UPEC emplean numerosos factores de virulencia, incluyendo cápsula, sistemas de adquisición de hierro, toxinas, un plásmido de virulencia, tRNAs, islas de patogenicidad y factores de colonización que han demostrado desempeñar un papel en la patogénesis <sup> 11-14. Fundamental para el establecimiento de la UPEC la colonización, la UPEC también codifican múltiples tipos de chaperón adhesiva ujier vía (CUP) pili que reconocen los receptores con especificidad estereoquímica ^15. Tipo 1 pili, punta con la adhesina FimH, se expresan por la UPEC y se unen uroplaquinas ¹⁶ y α-1, β-3 integrinas ^17, que se expresan en la superficie luminal de las dos vejigas humanas y de ratón ¹⁸ manosilado. Estas interacciones FimH mediada facilitan la colonización bacteriana y la invasión de las células epiteliales superficiales ^19,20. Una vez dentro de la célula, UPEC puede escapar al citoplasma, donde una sola bacteria puede dividirse rápidamente para formar una comunidad bacteriana intracelular (IBC), que, tras la maduración, puede contener ~ 10 ⁴ bacterias ^21. Formación de IBC se ha demostrado en al menos seis diferentes cepas de ratón, C3H / gallina, C3H / HeJ, C57Bl / 6, CBA, FVB / NJ y BALB / c, y con una amplia variedad de UPECepas C y otras enterobacterias ^22-24. Sin embargo las diferencias temporales y espaciales de la formación de IBC pueden variar dependiendo de los antecedentes del ratón y la cepa UPEC infectar. En ratones C3H / HeN infectadas con el prototipo de la UPEC cepas UTI89 o la formación CFT073, IBC pueden ser visualizados como pequeños biomasas de bacterias ya en 3 hpi (infección post hr). Esta comunidad sigue creciendo y alcanza un "punto medio" de desarrollo aproximadamente 6 hpi cuando las bacterias en forma de barra ocupan un gran porcentaje del espacio citoplásmico de células paraguas superficiales diferenciadas terminalmente Estos forma temprana los GRG de una manera relativamente sincrónica con la mayoría presentan dimensiones similares y morfologías. ~ 8 hpi las bacterias en el cambio de un IBC bacilos a cocos morfología. RIG son de naturaleza transitoria. Por lo tanto, IBC maduración 12-18 resultados hpi en continua expansión de la población bacteriana, seguida de su filamentation y la dispersión de la conexión wi celularth propagación posterior a las células vecinas ^23. Por lo tanto, el nicho IBC permite rápido crecimiento bacteriano en un entorno protegido de las respuestas y antibióticos ²⁵ inmune del huésped. Las distintas etapas de la infección UPEC que se ven en ratones también se observan en los seres humanos, tales como los RIG y filamentación, apoyando el modelo de ratón de infección del tracto urinario como una herramienta beneficiosa que puede ser utilizado para modelar UTI en los seres humanos ^22,26-28.

Si bien la mayoría de las mujeres experimentan una infección urinaria en su vida, el resultado de estas infecciones puede variar desde una infección autolimitada aguda sin recurrencia, a la cistitis recurrente frecuente. Además, los estudios han mostrado una fuerte incidencia familiar de IU, lo que sugiere un componente genético contribuye a la susceptibilidad UTI ^29. Hemos encontrado que los resultados UTI diferentes visto en las clínicas pueden ser reflejadas por los distintos resultados de la infección experimental UPEC entre puras cepas de ratón ^30. Por ejemplo, C3H / gallina, CBA, Los ratones DBA, y C3H / HeOuJ son susceptibles, en una forma dependiente de la dosis infecciosa, a la larga duración cistitis, crónica que se caracteriza por, bacterias alto título de persistentes (> 10 ⁴ unidades formadoras de colonias (ufc) / ml), bacterianas alto título cargas de la vejiga en el sacrificio> 4 semanas después de la infección (WPI), inflamación crónica y necrosis urotelial. Estos ratones también muestran niveles séricos elevados de IL-6, G-CSF, KC, y IL-5 dentro de la primera 24 hpi que sirven como biomarcadores para el desarrollo de la cistitis crónica. Esto puede representar con precisión el curso natural de la infección urinaria en algunas mujeres, ya que los estudios con placebo han demostrado que un gran porcentaje de las mujeres que experimentan ITU mantendrá altos niveles de bacterias en la orina durante varias semanas después de los primeros síntomas de la cistitis, si no se da tratamiento antibiótico ^{31 , 32.} Además, el uso de ratones C3H / HeN, se encontró que una historia de la cistitis crónica es un factor de riesgo significativo para posteriores infecciones recurrentes graves. IU recurrente es el más simanifestación clínica gnificant de IU y el ratón C3H / gallina es actualmente el único modelo estudiado que recapitula una mayor predisposición después de la exposición anterior. Un segundo resultado UTI se recapitula en ratones C57BL / 6, donde la infección aguda UPEC es autolimitada, con la resolución de la inflamación de la vejiga y la bacteriuria plazo aproximado de una semana. Curiosamente, en este modelo, UPEC formar fácilmente reservorios intracelulares quiescentes dentro del tejido de la vejiga de la que UPEC son capaces de salir de un estado latente para reiniciar una UTI activo, potencialmente explicar un mecanismo para misma cepa IU recurrente en seres humanos ^{33, 34.}

Además de las influencias genéticas en UTI susceptibilidad, la introducción de un catéter en la vejiga aumenta en gran medida la probabilidad de tener una infección, así como el aumento de la gama de bacterias capaces de causar una infección. Se ha demostrado que el cateterismo urinario humano provoca histológico ycambios inmunológicos en la vejiga debido a la tensión mecánica que se traduce en una respuesta inflamatoria robusta, exfoliación, edema de la lámina propia y submucusa, adelgazamiento urotelial, y lesión de la mucosa del urotelio y riñón ^35,36. Además, el catéter proporciona una superficie para la unión bacteriana a crear un entorno utilizado por varias especies de causar ITUAC. Mientras UPEC siguen siendo un importante contribuyente, Enterococcus faecalis representa el 15% de estos ITUAC ^37. E. faecalis es cada vez más resistente a los antibióticos con vancomicina aparición de resistencia, lo que plantea un problema de salud grave ^38. E. faecalis poseen numerosos factores de virulencia, incluyendo las toxinas y adhesinas necesarias para la unión a tanto el catéter y el epitelio ^38. Durante el cateterismo urinario, el anfitrión es vulnerable a la adhesión microbiana, multiplicación y diseminación en el ^39,40 de las vías urinarias. E. Faecalis forma una biopelícula en el catéter, como parte de un mecanismo de persistir en la vejiga y difundir a los riñones, que se reproduce en un modelo de ratón ITUAC ^41. Recientemente, se ha demostrado durante la cateterización urinaria, fibrinógeno (Fg) se libera en la vejiga, como parte de la respuesta inflamatoria. Fg se acumula en la vejiga, recubre el catéter y es esencial para E. faecalis la formación de biopelículas, que funciona como un andamio archivo adjunto. En un modelo de ratón C57BL / 6 de ITUAC, descubrimos que E. la formación de biopelículas faecalis en el catéter, y por lo tanto la persistencia en la vejiga, era dependiente de la pilus Ebp, específicamente su EBPA adhesina tip. Se encontró que el dominio N-terminal de EBPA se une específicamente a FG revestir el catéter. Además, se encontró que E. faecalis utiliza Fg como fuente metabolito durante la infección, mejorando así la formación de biopelículas ^42.

Los modelos de ratón han demostrado ser fundamental para understanding, así como la predicción de las manifestaciones clínicas de la infección del tracto urinario y la infección urinaria ^41. En este artículo se demuestra la preparación del inóculo de la cistitis UPEC aislamos UTI89 e inoculación transuretral de ratones C3H / HeN. Además, demostramos un protocolo para la inserción del catéter en ratones C57BL / 6 y la inoculación de la E. cepa faecalis OG1RF. Ambas técnicas conducen a UTI consistente y fiable o ITUAC en ratones. También mostramos técnicas utilizadas para observar la formación de IBC durante la cistitis aguda y de recogida de orina para el análisis de la cistitis crónica o recurrente. Ratones C3H / HeN se han utilizado para estudiar los aspectos de la UPEC patogénesis incluyendo invasión bacteriana inicial, la formación IBC, filamentación y el desarrollo de la cistitis crónica ^23,33,43. Estos parámetros de virulencia también se han estudiado en una variedad de otros antecedentes de ratón ^22,33. Para ITUAC, el / modelo C57BL 6 permite la implantación de un cuerpo extraño en la vejiga con la posterior co bacterianaionización, que se puede mantener durante 7 días después de la infección ^41. Estos modelos han sido útiles para la evaluación de los mecanismos de virulencia bacteriana, las respuestas del huésped a IU y mecanismos para subvertir las respuestas de acogida, gran parte del cual ha sido posteriormente recapituladas u observadas en las poblaciones humanas clínicos.

Protocol

Declaración de Ética: La Comisión de Estudios Animal de la Universidad de Washington aprobó todas las infecciones del ratón y procedimientos como parte del protocolo número 20120216, que fue aprobado y expira 11/01/2013 11/01/2016. El cuidado general de los animales fue consistente con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio del Consejo Superior de Investigaciones Científicas y la Guía de Recursos de Cuidado de Animales del USDA. Procedimientos de eutanasia son consistentes con las "direct…

Representative Results

Los modelos intravesical de IU asociada sin complicaciones y el catéter proporcionan plataformas flexibles para dilucidar los mecanismos moleculares de la patogénesis bacteriana, el impacto de estas enfermedades en el tejido de acogida, así como el desarrollo y ensayo de nuevos enfoques para gestionar estas infecciones comunes y costosos. Dependiendo de la cepa de ratón y el patógeno, la inoculación intravesical se puede utilizar para estudiar las interacciones huésped-patógeno para dilucidar los factores necesa…

Discussion

Comunidad no complicada adquirió UTI es una infección común y costoso que representa varios millones de consultas de atención primaria cada año ^46. Además, ITUAC son una infección adquirida sanitaria común que ha llegado a ser extremadamente costoso para los proveedores de salud como los Centros de Servicios de Medicare y Medicaid no reembolsa a los proveedores por el costo añadido de trato que resulta de un hospital adquirida ITUAC ^45. Los modelos de ratón de infección urinaria, tanto l…

Materials

Material for catheter and needle preparation:
30ga needles	BD Precision Glide	305106	30Gx ½ (0.3 mm x 13mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 mL
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs – Stainless Steel – Large Capacity –
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 in
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 in x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1X Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299