Etablering og karakterisering av UTI og CAUTI i en musemodell

Summary

The ability to model urinary tract infections (UTI) is crucial in order to be able to understand bacterial pathogenesis and spawn the development of novel therapeutics. This work’s goal is to demonstrate mouse models of experimental UTI and catheter associated UTI that recapitulate and predict findings seen in humans.

Abstract

Urinveisinfeksjoner (UVI) er svært utbredt, en viktig årsak til sykelighet og blir stadig mer motstandsdyktige mot behandling med antibiotika. Kvinner blir uforholdsmessig rammet av UTI: 50% av alle kvinner vil ha en UTI i sin levetid. I tillegg 20-40% av disse kvinnene som har en innledende UTI vil lide et tilbakefall med noen som lider hyppige tilbakefall med alvorlig forverret livskvalitet, smerte og ubehag, forstyrrelse av daglige aktiviteter, økt helsekostnader, og få behandlingstilbud andre enn langsiktige antibiotikaprofylakse. Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) er den primære utløsende agent for samfunnet ervervet UTI. Kateterassosierte UVI (CAUTI) er den vanligste sykehus ervervet infeksjon sto for en million hendelsene i USA årlig og dramatiske helseutgifter. Mens UPEC er også den primære årsaken til CAUTI, andre forårsaker agenter er av økt betydning inkludert Enterococcusfaecalis. Her bruker vi to veletablerte musemodeller som rekapitulere mange av de kliniske kjennetegn ved disse menneskelige sykdommer. For UTI, rekapitulerer en C3H / høne modell mange av funksjonene i UPEC virulens observert hos mennesker, inkludert vertsresponser, IBC dannelse og fila. For CAUTI, en modell ved bruk av C57BL / 6-mus, som beholder kateter blære implantater, har vist seg å være utsatt for E. faecalis blære infeksjon. Disse representative modeller blir brukt til å få slående ny innsikt i patogenesen av UTI sykdom, som fører til utvikling av nye behandlingsformer og ledelse eller forebyggingsstrategier.

Introduction

Urinveisinfeksjoner (UVI) er en av de vanligste bakterielle infeksjoner og kan deles inn i to kategorier basert på mekanismen av oppkjøpet, samfunnet og nosokomial ervervet UTI. Community-ervervet UVI oppstår ofte hos ellers friske kvinner og studier har vist at omtrent 50% av kvinnene vil ha minst en UTI i livet ^en. I tillegg er gjentakelse et stort problem. En kvinne som har en innledende akutt infeksjon har en 25-40% sjanse for å ha en annen infeksjon i løpet av seks måneder til tross for riktig antibiotikabehandling og mange kvinner fortsetter å ha hyppige tilbakefall ^to. Bakteriene som forårsaker disse infeksjonene blir også stadig mer antibiotikaresistente ytterligere konfunderende behandlingsprotokoller ^3-6. UTI påvirker millioner av mennesker hvert år koster cirka 2,5 milliarder dollar i helsevesenet relaterte utgifter i USA, understreker virkningen og utbredelsen av sykdommen1,7 .Nosocomial kjøpt UVI er i hovedsak knyttet til tilstedeværelse av fremmedlegemer som inneliggende kateter. Kateterassosierte UVI (CAUTI) er fortsatt den vanligste nosokomiale kjøpt UTI, sto for ~ 70-80% av slike infeksjoner ^8. Videre er CAUTI assosiert med økt sykelighet og dødelighet, og det er den mest vanlige årsaken til sekundære blodet infeksjoner ^9.

UPEC forbundet ervervet UVI er antatt å være forårsaket av innføringen av bakterier i blæren fra reservoarer i mage-tarmkanalen via mekanisk manipulasjon under samleie, dårlig hygiene eller andre mikrobielle populasjonsdynamikk mellom ulike verts nisjer ^10. Når du er inne i blæren, UPEC ansette mange virulens faktorer, blant annet kapsel, jern oppkjøp systemer, giftstoffer, en virulensplasmid, tRNAs, patogenitet øyer og koloniserings faktorer som har vist seg å spille en rolle i patogenesen <sup> 11-14. Kritisk til etablering av UPEC kolonisering, UPEC også kode flere typer lim anstand innlede pathway (CUP) pili som gjenkjenner reseptorer med stereo spesifisitet ^15. Type 1 pili, tippet med FimH adhesin, uttrykkes ved UPEC og binder mannosylated uroplakins ¹⁶ og α-1, 3 β-integriner ^17, som uttrykkes på den luminale overflaten av både humane og museblærer ^18. Disse FimH-mediert interaksjon lette bakteriell kolonisering og invasjon av den overfladiske epitelceller ^19,20. Når du er inne i cellen, kan UPEC flykte inn i cytoplasma der en enkelt bakterie kan raskt dele for å danne en intracellulær bakterie samfunnet (IBC), som ved modning, kan inneholde ~ 10 ⁴ bakterier ^21. IBC formasjonen har blitt vist i minst seks forskjellige musestammer, C3H / HeN, C3H / HeJ, C57BL / 6, CBA, FVB / NJ og BALB / c, og med en rekke forskjellige UPEC stammer og andre Enterobacteriaceae ^22-24. Men tidsmessige og romlige forskjeller i IBC formasjon kan variere avhengig av mus bakgrunnen og den infiserende UPEC belastning. I C3H / høne mus infisert med proto UPEC stammer UTI89 eller CFT073, IBC dannelse kan visualiseres som små biomasser av bakterier så tidlig som 3 HPI (timer etter infeksjon). Dette fellesskapet fortsetter å ekspandere og når en "midtpunkt" av utvikling ca. 6 HPI når stavformede bakterier opptar en stor andel av det cytoplasmatiske plass av terminalt differensierte overfladiske paraplyceller Disse tidlige IBC form i en forholdsvis synkron måte med flertallet viser tilsvarende dimensjoner og morfologi. ~ 8 HPI bakterier i IBC endring fra en basiller til kokker morfologi. IBCer er forbigående. Dermed IBC modning 12-18 HPI fører fortsatte utvidelsen av den bakterielle befolkningen, fulgt av sin fila og spredning ut av cellen with påfølgende spredning til nabocellene ^23. Dermed kan IBC nisje for rask bakterievekst i et miljø beskyttet mot vertsimmunresponser og antibiotika ^25. De forskjellige stadier av infeksjonen UPEC som er sett i mus er også observert hos mennesker, slik som IBCer og filamentering, som støtter musemodell for UTI som en gunstig verktøy som kan brukes til å modellere UTI hos mennesker ^22,26-28.

Mens et flertall av kvinner opplever en UTI i livet, kan utfallet av disse infeksjonene varierer fra akutt selvbegrensende infeksjon uten tilbakefall, hyppig tilbakevendende blærekatarr. Videre har studier vist en sterk familiær forekomst av UVI, noe som tyder på en genetisk komponent bidrar til UTI mottakelighet ^29. Vi har funnet ut at de ulike uti resultater sett i klinikker kan speiles av de ulike utfall av eksperimentell UPEC smitte blant innavlede musestammer ^30. For eksempel C3H / høne, CBA, DBA, og C3H / HeOuJ mus er utsatt, i en infeksiøs dose-avhengig måte, for langvarige, kronisk cystitt, karakterisert ved vedvarende høy titer bakterier (> 10 ⁴ kolonidannende enheter (CFU) / ml), høy titer bakterielle blære byrder på offer> 4 uker etter infeksjon (WPI), kronisk betennelse, og uroteliale nekrose. Disse musene viser også forhøyede serumnivåer av IL-6, G-CSF, KC, og IL-5 i de første 24 HPI som tjener som biomarkører for utvikling av kronisk cystitt. Dette kan nøyaktig representerer det naturlige UTI hos noen kvinner, som placebo studier har vist at en stor andel av kvinner opplever UTI vil beholde høye nivåer av bakterier i urinen i flere uker etter at de første symptomene på blærekatarr hvis ikke får antibiotikabehandling ^{31 , 32.} Videre bruker C3H / høne mus, fant vi ut at en historie med kronisk cystitt er en betydelig risikofaktor for senere alvorlige tilbakevendende infeksjoner. Residiverende UVI er den mest sibetydelige materielle klinisk manifestasjon av UTI og C3H / høne mus er foreløpig den eneste studerte modell som sammenfatter en økt disposisjon etter tidligere eksponering. En annen UTI utfallet rekapitulert i C57Bl / 6 mus hvor akutt UPEC infeksjon er selvbegrensende, med oppløsning på blærebetennelse og bakteriuri innen ca en uke. Interessant i denne modellen, UPEC lett danne hvil intracellulære reservoarer i blæren vev som UPEC er i stand til dukker opp fra en sovende tilstand å gjenoppta en aktiv UTI en mulig forklaring på en mekanisme for samme belastning residiverende UVI hos mennesker ^{33, 34.}

I tillegg til genetiske påvirkninger på UTI følsomhet, innføring av et kateter inn i blæren i stor grad øker sannsynligheten for å ha en infeksjon så vel som å øke omfanget av bakterier i stand til å forårsake en infeksjon. Det har blitt demonstrert at human urin kateterisering forårsaker histologiske ogimmunologiske forandringer i blæren på grunn av mekanisk påkjenning som resulterer i en robust inflammatorisk respons, peeling, ødem i lamina propria og submucusa, urothelial tynning, og mucosal lesjon av urothelium og nyre ^35,36. I tillegg gir kateteret en overflate for bakteriell feste for derved å skape et miljø som benyttes av flere arter for å forårsake CAUTI. Mens UPEC er fortsatt en stor bidragsyter, står Enterococcus faecalis for 15% av disse CAUTI ^37. E. faecalis blir stadig mer motstandsdyktige mot antibiotika med vancomycin motstand veksten, utgjør en alvorlig helseproblem ^38. E. faecalis besitter mange virulensfaktorer inkludert toksiner og adhesiner som er nødvendige for feste til både kateteret og epitelet ^38. Under urin kateterisering, verten er utsatt for mikrobiell adhesjon, formering og spredning i urinveiene ^39,40. E. faecalis danner en biofilm på kateteret som en del av en mekanisme for å vedvare i blæren og spre seg til nyrene, som er gjengitt i en muse CAUTI modell ^41. Nylig har det vist seg i løpet av urin kateterisering, er fibrinogen (Fg) slippes inn i blæren som del av den inflammatoriske respons. Fg akkumuleres i blæren, frakker kateteret og er avgjørende for E. faecalis biofilmdannelse, fungerer som et vedlegg stillaset. I en C57BL / 6 mus modell av CAUTI, oppdaget vi at E. faecalis biofilmdannelse på kateteret, og således utholdenhet i blæren, var avhengig av EBP pilus, spesielt dens spiss adhesin EbpA. Vi har funnet at det N-terminale domenet av EbpA spesifikt bindes til fg belegning av kateteret. I tillegg ble det funnet at E. faecalis benytter Fg som metabolitt kilden under infeksjon, og dermed forsterke biofilmdannelse ^42.

Musemodeller har vist seg kritisk til understanding samt forutsi kliniske manifestasjoner av UTI og CAUTI ^41. I denne artikkelen viser vi inoculum utarbeidelse av blærekatarr UPEC isolere UTI89 og transuretral inokulering av C3H / høne mus. I tillegg viser vi en protokoll for kateterinnleggelse i C57BL / 6 mus og inokulasjon av E. faecalis OG1RF belastning. Begge disse teknikker fører til konsekvent og pålitelig UTI eller CAUTI i mus. Vi viser også teknikker som brukes til å observere IBC formasjon under akutt cystitt og urinoppsamling for analyse av kroniske eller tilbakevendende cystitt. C3H / høne mus har blitt brukt til å studere aspekter av UPEC patogenesen inkludert innledende bakteriell invasjon, IBC formasjon, fila og utvikling av kronisk blærekatarr ^23,33,43. Disse virulens parametrene har også blitt studert i en rekke andre muse bakgrunn ^22,33. For CAUTI, tillater C57BL / 6-modellen for fremmedlegemer implantering inn i blæren med påfølgende bakterie colonization, som kan opprettholdes i 7 dager etter infeksjon ^41. Disse modellene har vært nyttig for å vurdere bakteriell virulensmekanismer, verts svar på UTI og mekanismer for å styrte verts responser, hvorav mye har blitt videre rekapitulert eller observert i kliniske menneskelige befolkninger.

Protocol

Etikk uttalelse: The Washington University Animal Studies Komiteen godkjente alle muse infeksjoner og rutiner som en del av protokollnummer 20120216, som ble godkjent 01/11/2013 og utløper 01/11/2016. Samlet seg av dyrene var i samsvar med guiden for omsorg og bruk av forsøksdyr fra National Research Council og USDA Animal Care Guide Resource. Eutanasi prosedyrer er i samsvar med de "AVMA retningslinjer for Avliving av dyr 2013 edition." 1. UPEC UTI Protocol, Inoculation Needle For…

Representative Results

De intravesikal modeller av ukomplisert og kateter forbundet UTI tilby fleksible plattformer for å belyse de molekylære mekanismene for bakteriell patogenesen, virkningen av disse sykdommene på verten vev, samt utvikling og testing av nye tilnærminger for å håndtere disse vanlige og kostbare infeksjoner. Avhengig av musestamme og patogen, kan intravesikal inokulering brukes til å studere vert-patogen interaksjoner for å belyse faktorene som er nødvendige for å igangsette eller modulere spiss (figur 1</…

Discussion

Ukomplisert ervervet UTI er en vanlig og kostbare infeksjon regnskap for flere millioner primærhelsetjenesten besøk hvert år ^46. I tillegg Cautis er et vanlig helse ervervet infeksjon som har blitt svært kostbart å helsepersonell som Centers for Medicare og Medicaid Services ikke lenger refunderer leverandører for den ekstra kostnaden for behandling som følge av sykehuset ervervet CAUTI ^45. De musemodeller av UTI, både ukomplisert cystitt og CAUTI, som er beskrevet i protokollene tilveie uv…

Materials

Material for catheter and needle preparation:
30ga needles	BD Precision Glide	305106	30Gx ½ (0.3 mm x 13mm)
PE10 polyethylene tubing	BD	427400	Inside diameter -0.011 in (0.28 mm); outside diameter – 0.024 in (0.61 mm)
RenaSIL 025 platinum cured silicon tubing	Braintree Scientific, Inc	SIL 025	inside diameter-0.012 x outside diameter 0.025, 25 ft coil
Material for infections:
Isoflourane – Isothesia	Butler Schein	29405	250 mL
Clear Glass Straight-Sided Jar	Kimble Chase	5413289V 21
Stainless Steel Tea Infuser	Schefs-Amazon		Premium Loose Leaf Tea Infuser By Schefs – Stainless Steel – Large Capacity –
Non-sterile cotton balls	Fisherbrand	22-456-880
50 ml Falcon tubes	VWR	89039-660
Isotec 3 -vaporizer	Ohmeda	1224478
Ear punch	Fisher Scientific	13-812-201	(when necessary)
Betadine solution	Betadine solution		10% Povidie-iodine topical solution
Q-tips	Fisher Scientific	22-037-924	6 in
Diapers for bench	Fisherbrand	14206 63	Absorbent Underpads (20”X36”mats)
Surgical lubricant	Surgilube	0281-0205-36
Dissecting scissor	Fine Science tools, INC	14084-08
Micro-Adson Forceps	Fine Science tools, INC	11018-12
1 ml syringe	BD	309659	Tuberculin slip tip
Parafilm	Bemis	PM996	4 in x 125 FT
Eppendorf rack	Fisherbrand	05-541-1
Eppendorf tubes	MIDSCI	AVX-T-17-C
Harvesting catheters, bladders and kidneys:
Homogenizer	PRO Scientific INC	Bio-Gen Pro 200
5 ml polypropylene round-bottom tube	BD	352063	for organ homogenization
Paper towel	Georgia-Pacific
Ethanol	Pharmco-AAPER	11100020S	200 proof
Costar™ Clear Polystyrene 96-Well Plates	Corning	3788
1X Phosphate sodium saline	Sigma-Aldrich	P3813
BRANSONIC Ultrasonic cleaner 1210	Branson Ultrasonics Corporation	1210
IBC materials:
6-well tissue culture test plate	Techno Plastic Products	92006
Pins	Fine Science Tools	26002-20
Sylgard 184	Dow Corning	3097358-1004	Silicone Elastomer Kit
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)	Invitrogen	15520-034	Ultrapure
N, N-Dimethylformamide	Sigma Aldrich	D4551
MgCl2 (Magnesium chloride)	Sigma Aldrich	M8266
Sodium deoxycholate	Sigma Aldrich	D6750
Nonidet-P40	Roche	11754599001	Octylphenolpoly(ethyleneglycolether)n
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate (K-ferrOcyanide)	Sigma Aldrich	P3289
Potassium hexacyanoferrate(III) (K-ferrIcyanide)	Sigma Aldrich	60299