L'application d'un système d'expression inductible pour étudier les interférences de facteurs de virulence bactérienne avec signalisation intracellulaire
Summary
The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.
Abstract
La technique présentée ici permet d'analyser une étape au cours de laquelle une protéine cible, ou en variante, une petite molécule, interagit avec les composants d'une voie de signalisation. La méthode est basée, d'une part, sur l'expression inductible d'une protéine spécifique pour initier un événement de signalisation à un pas prédéterminé et défini dans la cascade de signalisation sélectionné. Expression concomitante, d'autre part, du gène d'intérêt permet alors l'investigateur d'évaluer si l'activité de la protéine cible exprimée est situé en amont ou en aval de l'événement de signalisation initiée, en fonction de l'affichage de la voie de signalisation qui est obtenue. Ici, la cascade apoptotique a été choisi comme une voie de signalisation définis pour démontrer la fonctionnalité de protocole. Les bactéries pathogènes, telles que Coxiella burnetii, translocation des protéines effectrices qui interfèrent avec l'induction de la mort de la cellule hôte dans la cellule hôte afin d'assurer la survie des bactéries dans la cellule et pour promouvoir leurla diffusion dans l'organisme. Les C. protéines effectrices burnetii CAEB inhibe efficacement la mort de la cellule hôte après l'induction de l'apoptose avec la lumière UV ou à la staurosporine. Pour affiner à quelle étape CAEB interfère avec la propagation du signal apoptotique, protéines sélectionnées ayant une activité pro-apoptotique bien caractérisé ont été exprimés de manière transitoire dans une manière de doxycycline inductible. Si CAEB agit en amont de ces protéines, l'apoptose se dérouler librement. Si CAEB agit en aval, la mort cellulaire sera inhibée. Les protéines d'essai ont été sélectionnés Bax, qui agit au niveau de la mitochondrie, et de la caspase 3, ce qui est la principale protease exécuteur. CAEB interfère avec la mort cellulaire induite par l'expression de Bax, mais pas par la caspase 3 expression. CAEB, par conséquent, coopère avec la cascade apoptotique entre ces deux protéines.
Introduction
La virulence de nombreuses bactéries pathogènes Gram négatif dépend de systèmes de sécrétion spécialisés de détourner des cellules hôtes eucaryotes. Les bactéries utilisent ces systèmes de sécrétion d'injecter des protéines de virulence bactérienne (effecteurs) dans la cellule hôte afin de moduler une variété d'activités cellulaires et biochimiques. L'étude des protéines effectrices a non seulement fourni un remarquable aperçu sur les aspects fondamentaux de interactions hôte / pathogène mais aussi dans la biologie fondamentale des cellules eucaryotes 1. La modulation de l'apoptose de la cellule hôte a été démontré être un mécanisme de virulence important pour de nombreux agents pathogènes intracellulaires, et un certain nombre de protéines effectrices de modulation de l'apoptose ont été identifiés 9.2. Cependant, les mécanismes moléculaires précis d'activité demeurent insaisissables dans de nombreux cas.
Apoptose, une forme de mort cellulaire programmée, joue un rôle important dans les réponses immunitaires à l'infection 10. Deux principales voies conduisant à l'apoptose ontété identifiés: le ciblage des mitochondries (apoptose intrinsèque) ou la transduction directe du signal par les récepteurs de mort cellulaire à la membrane plasmique (apoptose extrinsèque). La voie de la mort cellulaire intrinsèque ou à médiation par les mitochondries est déclenché par des signaux intracellulaires et implique l'activation de Bax et Bak, deux membres pro-apoptotiques de la famille Bcl-2. Cette famille est composée de protéines régulatrices pro- et anti-apoptotiques qui contrôlent la mort des cellules 11-14. L'activation de l'apoptose conduit à une oligomérisation de Bax et Bak suivi ultérieur par perméabilisation de la membrane externe des mitochondries, ce qui entraîne la libération du cytochrome C dans le cytoplasme. Libération de cytochrome c initie l'activation des caspases effectrices 3 et 7 par activation de la caspase 9 dans le apoptosome 15. Cela conduit à la protéolyse de substrats sélectionnés qui, entre autres, des résultats de l'exposition de la phosphatidylsérine sur la surface de la cellule 16 et libère une DNase dédié qui fragmente chromatin 17,18.
Afin de déterminer l'emplacement dans la cascade apoptotique une protéine effectrice individuel gêne, un système d'expression inductible a été utilisé 19. Les systèmes de régulation pour l'expression conditionnelle de transgènes ont été un outil précieux dans l'analyse de la fonction d'une protéine dans la cellule ou de son importance pour les tissus, organes et le développement de l'organisme, ainsi que lors de l'initiation, la progression et l'entretien de la maladie 20-23. Typiquement, les systèmes de contrôle inductibles, tels que le système Tet 24 employée ici, forment une unité de transcription artificielle (voir Figure 1). Un composant est un facteur de transcription appelé tTA conçue artificiellement (transcription activateur tétracycline-dépendant), formé par fusion de répresseur de la transcription bactérienne 25 TetR à un domaine de protéine de mammifère qui médie l'activation transcriptionnelle ou taire 24,26. Le deuxième composant est un hybridepromoteur, appelé TRE (élément de tetracycline sensible), consistant en un promoteur minimal eucaryote, contenant au moins une boîte TATA et un site d'initiation de transcription, reliée à plusieurs répétitions de la site de liaison à l'ADN apparenté pour TetR, tetO 24,25. Le troisième composant est le ligand naturel de TetR, la tétracycline ou un de ses dérivés, tels que la doxycycline ou 25 anhydrotétracycline. Lors de l'addition de ligand dans le milieu de culture, TetR perd son affinité pour tetO et se dissocie du TRE. De ce fait, la transcription du gène cible est supprimée. L'expression du transgène peut, ainsi, être étroitement contrôlé d'une manière temps et dose-dépendante à la fois dans la culture cellulaire et chez les animaux 20,23,24. Avec tTA, l'expression du transgène se produit de manière constitutive, sauf en présence d'une tetracycline. Cela peut être un inconvénient dans l'étude des protéines cytotoxiques ou oncogènes parce tétracycline doit d'abord être retiré du système, avant transgène expression se produit et les effets de la protéine cible sur la cellule peut être surveillé. Cela peut prendre beaucoup de temps et ne sont pas toujours complète, en particulier dans 27 des animaux transgéniques. Pour remédier à cette limitation, un mutant avec TetR une réponse inverse de la présence de doxycycline a été utilisé pour générer un nouveau facteur de transcription, rtTA (tTA inverse) 28. Il se lie uniquement au TRE et, de façon concomitante, active la transcription en présence de doxycycline. Perméabilité résiduelle du système, à savoir., L'expression du transgène en l'absence de TRE lié facteur de transcription, provenant soit (i) d'effets de position à un site d'intégration génomique, (ii) à partir du TRE lui-même 29, ou (iii) de non spécifique de la liaison de tTA / rtTA 28, a été adressée par l'introduction d'un silencieux de transcription supplémentaire, appelée TTS (dépendant de la tétracycline silencieux transcription) 30 dans le système. Il forme un réseau de régulateur double avec rtTA (voir Figure 1).En l'absence de doxycycline, TTS se lie à TRE et arrête toute transcription reste activement. En présence de doxycycline, TTS dissocie de TRE et rtTA lie induire simultanément l'expression du gène cible. Cette couche supplémentaire de rigueur est souvent nécessaire pour exprimer des protéines cytotoxiques très actifs 31-34.
Grâce à ce système à double régulateur étroitement contrôlé, la cascade apoptotique peut être initié à une étape définie permettant l'analyse de savoir si la protéine effecteur donné peut interférer avec induction d'apoptose. Cette méthode ne peut pas être utilisé pour étudier l'activité anti-apoptotique des protéines effectrices bactériennes mais également pour l'expression inductible de protéines pro-apoptotiques ou toxiques, ou pour disséquer les interférences avec d'autres voies de signalisation.
Protocol
Representative Results
Discussion
De nombreuses bactéries pathogènes hébergent des systèmes de sécrétion ou de sécréter des protéines effectrices translocation bactérienne dans la cellule hôte. Ces protéines effectrices ont la capacité de moduler les processus et les voies dans la cellule hôte, ce qui permet aux bactéries de survivre et de se répliquer à l'intérieur de leur niche intracellulaire respectif. Comprendre les activités biochimiques et les mécanismes moléculaires des protéines effectrices aidera à une meilleure comp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.
Materials
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
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