Применяя INDUCIBLE системы экспрессии для изучения помех бактериальных факторов вирулентности с внутриклеточной сигнализации
Summary
The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.
Abstract
Методика представлена здесь позволяет проанализировать, на каком шаге целевой белок, или, альтернативно, малую молекулу, взаимодействует с компонентами сигнального пути. Метод основан, с одной стороны, на индуцируемой экспрессии специфического белка, чтобы инициировать событие сигнализации на определенном и заранее определенного этапа в выбранной сигнального каскада. Одновременное выражение, с другой стороны, из представляющего интерес гена, то позволяет исследователю оценить, если активность экспрессированного белка-мишени расположена выше по потоку или ниже по потоку от инициированного событием сигнализации, в зависимости от считывания сигнального пути, который получают. Здесь апоптическая каскад была выбрана в качестве определенного сигнального пути, чтобы продемонстрировать функциональность протокола. Патогенные бактерии, такие как Coxiella burnetii, перемещать эффекторные белки, которые мешают клетка-хозяин смерти индукции в клетке-хозяине, чтобы обеспечить выживаемость бактерий в клетки и способствовать ихраспространение в организме. С. burnetii белок эффектор CAEB эффективно подавляет клетки-хозяина смерть после индукции апоптоза с УФ-света или с стауроспорином. Чтобы сузить при котором шаг CAEB мешает распространения сигнала апоптоза, были выражены временно в доксициклин индуцибельной образом выбранные белки с хорошо охарактеризованной проапоптотического деятельности. Если CAEB действует выше этих белков апоптоза будет беспрепятственно продолжаться. Если CAEB действует ниже, гибель клеток будет запрещено. Испытуемые были выбраны белки Bax, который действует на уровне митохондрии, и каспазы 3, который является основным палач протеазы. CAEB мешает гибели клеток, вызванной выражения Вах, но не каспазы 3 выражения. CAEB, таким образом, взаимодействует с каскадом апоптоза между этими двумя белками.
Introduction
Вирулентность многих грамотрицательных бактериальных патогенов зависит от специализированных систем секреции угнать эукариотических клеток-хозяев. Бактерии используют эти системы секреции вводить бактериальные белки вирулентности (эффекторов) в клетки-хозяина, чтобы модулировать различные клеточные и биохимические деятельности. Изучение эффекторных белков не только при условии, замечательный понимание фундаментальных аспектов принимающих / патогенных взаимодействий, но и в фундаментальной биологии эукариотических клеток 1. Модуляция апоптоза клетки-хозяина, как было показано, является важным механизмом вирулентности в течение многих внутриклеточных патогенов, а также ряд эффекторных белков, модулирующих апоптоз были идентифицированы 2-9. Тем не менее, их точные молекулярные механизмы остаются неизвестными активности во многих случаях.
Апоптоз, форма запрограммированной клеточной смерти, играет важную роль в иммунных реакций на инфекции 10. Два основных пути, ведущие к апоптозу естьбыли определены: таргетинг митохондрий (внутренняя апоптоз) или прямой трансдукции сигнала через гибель клеток рецепторов на мембране (внешняя апоптоза). Внутренняя или митохондрии-опосредованной клеточной смерти путь инициируется внутриклеточных сигналов, и включает в себя активацию Bax и Bak, двух про-апоптотических членов семьи Bcl-2. Это семейство состоит из про- и анти-апоптотических белков регулятора, которые контролируют клеточную гибель 11-14. Активация апоптоза приводит к олигомеризации Bax и Бак с последующей проницаемости митохондриальной наружной мембраны, в результате чего цитохрома C высвобождения в цитоплазму. Цитохром С релиз инициирует активацию эффекторных каспаз 3 и 7 через активацию каспазы 9 в апоптосома 15. Это приводит к протеолиза отдельных подложек, которые, среди прочего, приводит к воздействию фосфатидилсерина на поверхности клеток 16 и освобождает выделенный ДНКазы, что фрагменты чromatin 17,18.
Для того чтобы определить, где в каскаде апоптоза индивидуальный белок эффектор мешает, индуцируемый система экспрессии был использован 19. Регулирующие системы условного выражения трансгенов было бесценным инструментом в анализе функции белка в клетке или его значение для ткани, органа и развития организма, а также при инициации, прогрессировании и поддержание болезни 20-23. Как правило, индуцируемые системы управления, такие как системы Tet 24, используемое здесь, образуют искусственное транскрипционной единицы (рисунок 1). Один компонент представляет собой искусственно сконструированную транскрипционный фактор, называемый TTA (тетрациклин-зависимой транскрипции активатор), образованный слиянием бактериальной транскрипции репрессором TetR 25 до млекопитающих домена белка, который опосредует активацию транскрипции или глушителей 24,26. Второй компонент представляет собой гибридпромоутер, называется TRE (тетрациклин проблематику элемент), состоящий из эукариотической минимального промотора, содержащего, по меньшей мере, ТАТА-бокс и сайт инициации транскрипции, присоединился к нескольким повторами родственного ДНК-связывающего сайта для тетр, Teto 24,25. Третьим компонентом является естественным лигандом TetR, тетрациклина или одного из его производных, таких как anhydrotetracycline или доксициклин 25. При лиганда дополнение к культуральной среде, TetR теряет сродство к Teto и отделяется от TRE. В результате транскрипции гена-мишени отменена. Экспрессии трансгена могут, таким образом, строго контролироваться в времени и зависимым от дозы образом как в культуре клеток и животных 20,23,24. С TTA, трансгенная экспрессия происходит конститутивно, за исключением того, в присутствии тетрациклина. Это может быть недостатком в исследовании цитотоксических или онкогенных белков, поскольку тетрациклин сначала должен быть удален из системы, перед тем трансгенной expressioп происходит и эффекты белка-мишени на клетке можно контролировать. Это может быть трудоемким и не всегда бывает полным, особенно в трансгенных животных 27. Для решения это ограничение, TetR мутант с обратной ответ на присутствие доксициклина был использован для создания нового фактора транскрипции, rtTA (обратный TTA) 28. Это связывается только с TRE и, одновременно, активирует транскрипцию в присутствии доксициклина. Остаточный неплотности системы, т.е.., Трансген выражение в отсутствии TRE-связанного фактора транскрипции, происходящий либо (I) от эффектов положения в геномной сайта интеграции, (II) от самого TRE 29, или (III) от не -специфический связывающий ТТА / rtTA 28, был адресован введением дополнительного транскрипции глушитель, называют TTS (тетрациклин-зависимой транскрипции глушитель) 30 к системе. Он образует двойную сеть регулятор вместе с rtTA (рисунок 1).При отсутствии доксициклин, ТЦ связывается с TRE и активно выключается оставшуюся транскрипции. В присутствии доксициклина, TTS диссоциирует от TRE и rtTA связывает одновременно индукции экспрессии гена-мишени. Этот дополнительный слой жесткости часто необходимо, чтобы выразить высокоактивные цитотоксические белки 31-34.
Используя этот жестко контролируется система двойного регулятора, апоптическая каскад может быть начато при определенной стадии, позволяющей анализ может ли данный белок эффектор мешать индукции апоптоза. Этот метод не может быть использован только для изучения антиапоптозную активности бактериальных эффекторных белков, но и для индуцируемой экспрессии про-апоптотических или токсичных белков или для рассечения помех других сигнальных путей.
Protocol
Representative Results
Discussion
Многие патогенные бактерии гавани секреции систем выделяют или перемещать бактериальных эффекторных белков в клетке-хозяине. Эти эффекторные белки обладают способностью модулировать процессы и пути в клетке-хозяине, что позволяет бактериям выжить и воспроизвести в соответствии с и?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.
Materials
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
References
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
- Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
- Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
- Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
- Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
- Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
- Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
- Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
- Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
- Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
- Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
- Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
- Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
- Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
- Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
- Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
- Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
- Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
- Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
- Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
- Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
- Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
- Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
- Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
- Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
- Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
- Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
- Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
- Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
- Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
- Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
- Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
- Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
- Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).
