Tillämpa ett inducerbart uttryck system att studera Störningar av bakteriell Virulensfaktorer med intracellulära signal
Summary
The method described here is used to induce the apoptotic signaling cascade at defined steps in order to dissect the activity of an anti-apoptotic bacterial effector protein. This method can also be used for inducible expression of pro-apoptotic or toxic proteins, or for dissecting interference with other signaling pathways.
Abstract
Tekniken presenteras här tillåter en att analysera på vilket steg ett målprotein, eller alternativt en liten molekyl, interagerar med komponenterna i en signalväg. Metoden är baserad, å ena sidan, å inducerbart uttryck av ett specifikt protein för att initiera en händelse signalerings vid en definierad och förutbestämt steg i det valda signaleringskaskad. Samtidig uttryck, å andra sidan, av genen av intresse då tillåter forskaren att utvärdera om aktiviteten hos det uttryckta målproteinet är placerad uppströms eller nedströms om den initieras signalerings händelsen, beroende på utläsningen av signalvägen som erhålls. Här var apoptotiska kaskaden valts som en definierad signalväg för att visa protokoll funktionalitet. Patogena bakterier, såsom Coxiella burnetii, translokera effektorproteiner som stör värd celldöd induktion i värdcellen för att säkerställa bakterie överlevnad i cellen och att främja derasspridning i organismen. C. burnetii-effektorprotein CaeB inhiberar effektivt värd celldöd efter induktion av apoptos med UV-ljus eller med staurosporin. Att begränsa antalet vid vilket steg CaeB stör utbredningen av den apoptotiska signalen, selekterades proteiner med välkarakteriserad pro-apoptotisk aktivitet uttryckt transient i en doxycyklin-inducerbart sätt. Om CaeB agerar uppströms av dessa proteiner, kommer apoptos fortsätta obehindrat. Om CaeB agerar nedströms kommer celldöd hämmas. Test proteinerna valdes ut var Bax, som verkar vid nivån för mitokondrierna, och kaspas 3, vilket är det största bödeln proteas. CaeB stör celldöd inducerad av Bax uttryck, men inte av kaspas 3 uttryck. CaeB således samverkar med den apoptotiska kaskaden mellan dessa två proteiner.
Introduction
Virulensen av många gramnegativa bakteriella patogener beror på specialiserade sekretionssystem för att kapa eukaryota värdceller. Bakterier använder dessa sekretionssystem för att injicera bakteriella virulensproteiner (Effekten) in i värdcellen för att modulera en mängd cellulära och biokemiska aktiviteter. Studiet av effektorproteiner har inte bara gett anmärkningsvärd inblick i grundläggande aspekter av värd / patogen interaktioner men också i den grundläggande biologi eukaryota celler 1. Modulering av värdcell apoptos har visat sig vara en viktig mekanism virulens för många intracellulära patogener, och ett antal effektorproteiner modulerar apoptos har identifierats 2-9. Men deras exakta molekylära mekanismer av aktivitet förblir svårfångade i många fall.
Apoptos, en form av programmerad celldöd, spelar en viktig roll i immunsvar mot infektion 10. Två huvudvägar som leder till apoptos haridentifierats: targeting mitokondrierna (intrinsisk apoptos) eller direkt transduktion av signalen via celldödsreceptorer på plasmamembranet (extrinsic apoptos). Den inneboende eller mitokondrier-förmedlad celldöd vägen utlöses av intracellulära signaler involverar aktivering av Bax och Bak, två proapoptotiska medlemmar av Bcl-2 familjen. Denna familj består av pro- och anti apoptotiska regulator proteiner som styr celldöd 11-14. Aktivering av apoptos leder till oligomerisering av Bax och Bak följt av efterföljande permeabilization av mitokondriell yttre membran, vilket resulterar i cytokrom C släpps ut i cytoplasman. Cytokrom C frisättning initierar aktivering av effektor kaspaser 3 och 7 genom aktivering av kaspas 9 i apoptosome 15. Detta leder till proteolys av valda substrat som, bland andra, resulterar i exponeringen av fosfatidylserin på cellytan 16 och frigör en dedikerad DNas att fragment chromatin 17,18.
För att avgöra var inom den apoptotiska kaskaden en enskild effektorprotein stör, var ett inducerbart uttryckssystem som används 19. Regelsystem för villkorligt uttryck av transgener har varit ett ovärderligt verktyg för att analysera en proteinets funktion i cellen eller dess betydelse för vävnad, organ och organism utveckling, liksom under initiering, progression och underhåll av sjukdom 20-23. Typiskt inducerbara kontrollsystem, såsom Tet-systemet 24 som används här, bildar en artificiell transkriptionsenhet (se fig 1). En komponent är en artificiellt konstruerad transkriptionsfaktor kallad tTA (tetracyklin-beroende transkription aktivator), som bildas genom fusion av bakteriella transkriptions repressorn TetR 25 till en däggdjursproteindomän som medierar transkriptionsaktivering eller ljuddämpnings 24,26. Den andra komponenten är en hybridpromotor, benämnd TRE (tetracyklin-responselement), som består av en eukaryot minimal promotor, som innehåller åtminstone en TATA-box och ett transkriptionsinitieringsställe, förenad med multipla upprepningar av det besläktade DNA-bindningsställe för TetR, tetO 24,25. Den tredje komponenten är den naturliga liganden av TetR, tetracyklin eller ett av dess derivat, såsom anhydrotetracyklin eller doxycyklin 25. Vid ligand tillsats till odlingsmediet, förlorar TetR dess affinitet för tetO och dissocierar från TRE. Som ett resultat, är transkription av målgenen avskaffas. Transgen expression kan således vara hårt kontrollerad på ett tids- och dosberoende sätt i både cellkultur och i djur 20,23,24. Med tTA sker transgenexpression konstitutivt, utom i närvaro av en tetracyklin. Detta kan vara en nackdel i studiet av cytotoxiska eller onkogena proteiner eftersom tetracyklin måste först tas bort från systemet, innan transgen expression inträffar och målproteinet effekter på cellen kan övervakas. Detta kan vara tidskrävande och är inte alltid fullständig, särskilt i transgena djur 27. För att ta itu med denna begränsning, har en TetR mutant med en invers svar på närvaron av doxycyklin som används för att generera en ny transkriptionsfaktör, rtTA (omvänd tTA) 28. Det binder endast till TRE och, samtidigt, aktiverar transkription i närvaro av doxycyklin. Återstående läckage av systemet, dvs., Transgenexpression i frånvaro av TRE bundna transkriptionsfaktor, ursprung antingen (i) från positionseffekter på en genomisk plats integration, (ii) från TRE själv 29, eller (iii) från icke specifik bindning av TTA / rtTA 28 riktades genom att införa en ytterligare transkriptions ljuddämpare, kallas TTS (tetracyklin beroende transkriptions ljuddämpare) 30 till systemet. Den bildar en dubbelregulator nätet tillsammans med rtTA (se figur 1).I avsaknad av doxycyklin, binder TTS till TRE och stänger eventuellt kvarvarande transkription aktivt. I närvaro av doxicyklin, TTS dissocierar från TRE och rtTA binder samtidigt inducera uttryck av målgenen. Detta extra lager av stringens är ofta nödvändigt att uttrycka högaktiva cytotoxiska proteiner 31-34.
Med hjälp av denna hårt kontrollerad dubbla reglersystem, kan den apoptotiska kaskaden initieras vid en definierad steg möjliggör analys av huruvida den givna effektorprotein kan störa apoptosinduktion. Denna metod kan inte bara användas för att studera den anti-apoptotisk aktivitet av bakteriella effektorproteiner utan även för den inducerbara expressionen av proapoptotiska eller toxiska proteiner, eller för att dissekera interferens med andra signalvägar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Många patogena bakterier hamnen sekretionssystem att utsöndra eller translokera bakteriella effektor proteiner i värdcellen. Dessa effektorproteiner har kapacitet att modulera processer och vägar i värdcellen, vilket gör att bakterier att överleva och replikera inom respektive intracellulär nisch. Förstå biokemiska aktiviteter och molekylära mekanismer för effektorproteiner kommer att bidra till en bättre förståelse av patogenicitet och kan bidra till att utveckla nya terapeutiska verktyg för att bekämp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) through the Collaborative Research Initiative 796 (SFB796) to A.L. and C.B., and through the ERA-NET PathoGenoMics 3rd call to A.L.
Materials
| DMEM | life technologies | 31966-021 | |
| FCS | Biochrom | S0115 | |
| Pen/Strep | life technologies | 15140-122 | |
| OptiMEM | life technologies | 51985 | |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365752001 | |
| Geneticin | Roth | CP11.3 | |
| Polyethylenimine | Polyscienes | 23966 | |
| Doxycycline | Sigma Aldrich | D9891 | |
| Mini-PROTEAN Tetra Cell | Bio-Rad | 165-8000EDU | |
| Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer Cell | Bio-Rad | 170-3940 | |
| PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | |
| anti-GFP | life technologies | A6455 | |
| anti-cleaved PARP | BD Bioscience | 611038 | |
| anti-actin | Sigma Aldrich | A2066 | |
| Mouse IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-062 | |
| Rabbit IgG (H+L)-HRPO | Dianova | 111-035-045 | |
| ECL Western Blotting Substrate | Thermo Scientific | 32106 | |
| Restore Plus Western Blot Stripping Buffer | Thermo Scientific | 46428 |
References
- Galán, J. E. Common themes in the design and function of bacterial effectors. Cell Host Microbe. 5 (6), 571-579 (2009).
- Banga, S., et al. Legionella pneumophila inhibits macrophage apoptosis by targeting pro-death members of the Bcl2 protein family. Proc Natl Acad Sci USA. 104 (12), 5121-5126 (2007).
- Laguna, R. K., Creasey, E. A., Li, Z., Valtz, N., Isberg, R. R. A Legionella pneumophila-translocated substrate that is required for growth within macrophages and protection from host cell death. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (49), 18745-18750 (2006).
- Schmid, M. C., et al. A translocated bacterial protein protects vascular endothelial cells from apoptosis. PLoS Pathog. 2 (11), e115 (2006).
- Nogueira, C. V., Carey, K. L., Roy, C. R. Inhibition of pathogen-induced apoptosis by a Coxiella burnetiitype IV effector protein. Proc Natl Acad Sci USA. 107 (44), 18997-19001 (2010).
- Rudel, T., Kepp, O., Kozjak-Pavlovic, V. Interactions between bacterial pathogens and mitochondrial cell death pathways. Nat Rev Microbiol. 8 (10), 693-705 (2010).
- Klingenbeck, L., Eckart, R. A., Berens, C., Lührmann, A. The Coxiella burnetii type IV secretion system substrate CaeB inhibits intrinsic apoptosis at the mitochondrial level. Cell Microbiol. 15 (4), 675-687 (2012).
- Raymond, B., et al. Subversion of trafficking, apoptosis, and innate immunity by type III secretion system effectors. Trends Microbiol. 21 (8), 430-441 (2013).
- Eckart, R. A., et al. Antiapoptotic activity of Coxiella burnetii effector protein AnkG is controlled by p32-dependent trafficking. Infect Immun. 82 (7), 2763-2771 (2014).
- Byrne, G. I., Ojcius, D. M. Chlamydia and apoptosis: life and death decisions of an intracellular pathogen. Nat Rev Microbiol. 2 (10), 802-808 (2004).
- Delft, M. F., Huang, D. C. S. How the Bcl-2 family of proteins interact to regulate apoptosis. Cell Res. 16 (2), 203-213 (2006).
- Willis, S. N., Adams, J. M. Life in the balance: how BH3-only proteins induce apoptosis. Curr Opin Cell Biol. 17 (6), 617-625 (2005).
- Shamas-Din, A., Kale, J., Leber, B., Andrews, D. W. Mechanisms of action of Bcl-2 family proteins. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (4), a008714 (2013).
- Cory, S., Adams, J. M. The Bcl2 family: regulators of the cellular life-or-death switch. Nat Rev Cancer. 2 (9), 647-656 (2002).
- Adams, J. M., Cory, S. Apoptosomes: engines for caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 14 (6), 715-720 (2002).
- Suzuki, J., Denning, D. P., Imanishi, E., Horvitz, H. R., Nagata, S. Xk-related protein 8 and CED-8 promote phosphatidylserine exposure in apoptotic cells. Science. 341 (6144), 403-406 (2013).
- Cory, S. Cell death throes. Proc Natl Acad Sci USA. 95 (21), 12077-12079 (1998).
- Enari, M., et al. A caspase-activated DNase that degrades DNA during apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature. 391 (6662), 43-50 (1998).
- Fussenegger, M. The impact of mammalian gene regulation concepts on functional genomic research, metabolic engineering, and advanced gene therapies. Biotechnol Prog. 17 (1), 1-51 (2001).
- Felsher, D. W. Reversibility of oncogene-induced cancer. Curr Opin Genet Dev. 14 (1), 37-42 (2004).
- Maherali, N., et al. A high-efficiency system for the generation and study of human induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 3 (3), 340-345 (2008).
- Kozlova, E. N., Berens, C. Guiding differentiation of stem cells in vivo by tetracycline-controlled expression of key transcription factors. Cell Transplant. 21 (12), 2537-2554 (2012).
- Reijmers, L., Mayford, M. Genetic control of active neural circuits. Front Mol Neurosci. 2, 27 (2009).
- Gossen, M., Bujard, H. Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters. Proc Natl Acad Sci USA. 89 (12), 5547-5551 (1992).
- Hillen, W., Berens, C. Mechanisms underlying expression of Tn10 .encoded tetracycline resistance. Annu Rev Microbiol. 48, 345-369 (1994).
- Deuschle, U., Meyer, W. K., Thiesen, H. J. Tetracycline-reversible silencing of eukaryotic promoters. Mol Cell Biol. 15 (4), 1907-1914 (1995).
- Robertson, A., Perea, J., Tolmachova, T., Thomas, P. K., Huxley, C. Effects of mouse strain, position of integration and tetracycline analogue on the tetracycline conditional system in transgenic mice. Gene. 282 (1-2), 65-74 (2002).
- Gossen, M., et al. Transcriptional activation by tetracyclines in mammalian cells. Science. 268 (5218), 1766-1769 (1995).
- Rang, A., Will, H. The tetracycline-responsive promoter contains functional interferon-inducible response elements. Nucleic Acids Res. 28 (5), 1120-1125 (2000).
- Freundlieb, S., Schirra-Müller, C., Bujard, H. A tetracycline controlled activation/repression system with increased potential for gene transfer into mammalian cells. J Gene Med. 1 (1), 4-12 (1999).
- Knott, A., et al. An optimized conditional suicide switch using doxycycline-dependent expression of human tBid. Cancer Biol Ther. 4 (5), 532-536 (2005).
- Danilchanka, O., et al. An outer membrane channel protein of Mycobacterium tuberculosis with exotoxin activity. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (18), 6750-6755 (2014).
- Danke, C., et al. Adjusting transgene expression levels in lymphocytes with a set of inducible promoters. J Gene Med. 12 (6), 501-515 (2010).
- Maueröder, C., Chaurio, R. A., Platzer, S., Munoz, L. E., Berens, C. Model systems for rapid and slow induction of apoptosis obtained by inducible expression of pro-apoptotic proteins. Autoimmunity. 46 (5), 329-335 (2013).
- Srinivasula, S. M., et al. Generation of constitutively active recombinant caspases-3 and -6 by rearrangement of their subunits. J Biol Chem. 273 (17), 10107-10111 (1998).
- Baron, U., Freundlieb, S., Gossen, M., Bujard, H. Co-regulation of two gene activities by tetracycline via a bidirectional promoter. Nucleic Acids Res. 23 (17), 3605-3606 (1995).
- Anastassiadis, K., et al. A predictable ligand regulated expression strategy for stably integrated transgenes in mammalian cells in culture. Gene. 298 (2), 159-172 (2002).
- Qu, Z., et al. Homogeneity and long-term stability of tetracycline-regulated gene expression with low basal activity by using the rtTA2S-M2 transactivator and insulator-flanked reporter vectors. Gene. 327 (1), 61-73 (2004).
- Spencer, S. L., Gaudet, S., Albeck, J. G., Burke, J. M., Sorger, P. K. Non-genetic origins of cell-to-cell variability in TRAIL-induced apoptosis. Nature. 459 (7245), 428-432 (2009).
- Agha-Mohammadi, S., et al. Second-generation tetracycline-regulatable promoter: repositioned tet operator elements optimize transactivator synergy while shorter minimal promoter offers tight basal leakiness. J Gene Med. 6 (7), 817-828 (2004).
- Pluta, K., Luce, M. J., Bao, L., Agha-Mohammadi, S., Reiser, J. Tight control of transgene expression by lentivirus vectors containing second-generation tetracycline-responsive promoters. J Gene Med. 7 (6), 803-817 (2005).
- Hoffmann, A., Villalba, M., Journot, L., Spengler, D. A novel tetracycline-dependent expression vector with low basal expression and potent regulatory properties in various mammalian cell lines. Nucleic Acids Res. 25 (5), 1078-1079 (1997).
- Loew, R., Heinz, N., Hampf, M., Bujard, H., Gossen, M. Improved Tet-responsive promoters with minimized background expression. BMC Biotechnol. 10, 81 (2010).
- Heinz, N., et al. Retroviral and transposon-based tet-regulated all-in-one vectors with reduced background expression and improved dynamic range. Hum Gene Ther. 22 (2), 166-176 (2011).
- Toniatti, C., Bujard, H., Cortese, R., Ciliberto, G. Gene therapy progress and prospects: transcription regulatory systems. Gene Ther. 11 (8), 649-657 (2004).
- Ye, H., Fussenegger, M. Synthetic therapeutic gene circuits in mammalian cells. FEBS Lett. 588 (15), 2537-2544 (2014).
