神経発達障害のマウスモデルにおける空間学習した後、海馬ニューロン活動の免疫組織化学的可視化
Summary
我々は、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するために免疫組織化学プロトコルを記述します。このプロトコルは、認知障害によって特徴付けられる遺伝的または薬理学的両方のマウスモデルに適用することができます。
Abstract
リン酸化され、細胞外調節キナーゼ（のpERK）の誘導は、学習に依存する神経活動の信頼性の分子読み出しです。ここでは、神経発達の起源の認知障害によって特徴づけられるマウスモデルにおける空間学習課題への曝露後の海馬ニューロンの活性化のプロファイルを研究するためのpERK免疫組織化学プロトコルを記述します。マウス、自閉症スペクトラム障害（ASD）のモデル具体的には、エングレイルド-2ノックアウト（ – / –たEn2）におけるモリス水迷路（MWM、古典的海馬依存性学習課題）後の神経の活性化を研究するためのpERK免疫染色を使用していました。野生型（WT）対照と比較して、たEn2 – / –マウスは、MWMにおける重要な空間的学習障害を示しました。 WT動物と比較して、マウス– / – MWM後、pERKの陽性ニューロンの数の有意差は、特定の海馬たEn2のサブフィールドで検出されました。したがって、我々のプロトコルは、ロバストの違いを検出することができますASDのマウスモデルにおいて、海馬依存性学習障害に関連付けられているのpERK陽性ニューロン。より一般的には、我々のプロトコルは、認知障害の両方により特徴づけられる遺伝的または薬理学的なマウスモデルにおいて、海馬ニューロンの活性化のプロファイルを調査するために適用することができます。
Introduction
神経発達障害は、中枢神経系（CNS）の開発および成熟が中に早期に乱されたダウン症候群、脆弱X症候群（FXS）、レット症候群、神経線維腫症、結節性硬化症やASD、などの障害の広い異種基などが挙げられます出生前の期間1。これらの発達脳機能障害は、運動機能、言語、学習と記憶のプロセスに深刻な、生涯影響を引き起こす可能性があります。遺伝的要因と環境要因の過多は、ここ数年の間に2,3神経発達障害の病因に関与しています。臨床表現型の根底にある分子メカニズムは不明のままであっても、上記の知見は、これらの障害のいくつかのマウスモデルの開発を可能にしています。学習および記憶障害には、TSC1 +/-、TSC2 +/-としてこれらのマウスモデルの数が特定されています、NF1 +/-と EN2 – / –マウス2,4-7。神経発達障害の分野における重要な課題は、記憶や学習障害の基礎となる細胞および分子プロセスの同定です。学習または記憶の間に活性化、選択のシグナル伝達経路は、特定の遺伝子の転写を誘導し、最終的にデノボのタンパク質合成につながることができます。即時初期遺伝子（IEGs）の活性化およびタンパク質依存性シナプス修飾は、急速に神経活動と行動訓練8,9に応じて脳の神経細胞に誘導されます。
ニューロフィブロミンを含むシグナル伝達経路の欠損は神経発達障害における学習障害と関連しています。ニューロフィブロミンは、変異神経線維腫症1型の原因となるNF1遺伝子、神経系腫瘍によって特徴付けられる複雑な遺伝性症候群、行動、モータ遅延、および認知DISAの製品ですbilities 10。抑制性ニューロンに制限NF1欠失についてヘテロ接合マウスは、長期増強（LTP）の初期段階だけでなく、MWM 5,11,12、侵入した空間学習の欠損を示します。興味深いことに、このマウスモデルにおけるNF1欠損が増加ERKのリン酸化、最終的にこれらのニューロン5からのGABA放出の異常な増強を生じ、学習の間に介在阻害におけるRASシグナリングの過剰活性化をもたらします。
これらの知見に基づいて、行動タスク後の神経活動の可視化は、神経疾患に関与する特定の回路を再構成する方法を示しています。ここで説明する免疫組織化学プロトコルは、認知障害とASDマウスモデルにおいてMWMを次の海馬ERKリン酸化レベルを評価し、定量化することを目指しています。 MWMは広くげっ歯類13,14に海馬依存空間学習および記憶を調べるために使用され</s>アップ。我々は、ERKは、学習と記憶形成の15において重要な役割を有することが示されたため、タスク依存海馬学習の分子読み出しとしてERKリン酸化を使用することを決定しました。また、ERK経路は、開発視覚野16における経験依存的可塑性のために必要です。最後に、CNSショーで2 ERKアイソフォーム（ERK2）のいずれかを欠損したマウスは、ERKシグナルは、ASDなどの神経発達障害の病因に重要な役割を果たしている可能性があることを示し、認知感情的、社会的行動17の異常をマーク。
神経発達障害のモデルとしてマウス（ – / –たEn2）私たちは、エングレイルド2ノックアウトを使用していました。 EN2 – / –マウスは、前脳の介在18の損失を含む解剖学的および行動「ASD様」機能では、ASD関連遺伝子19の発現低下を示し、社交性を減少し、損なわれた認知の柔軟性6,7,20。空間learni– / –マウス6,7および21 ASD患者で観察された認知機能障害に関連する可能性があるようなMWMで検出されたものとしてNGとメモリの欠陥は、たEn2、特に堅牢です。 – / –成体マウス7さらに、我々は、MWMにおける減損空間学習が減少ニューロフィブロミンの発現に関連するとEN2の門でのpERKレベルを増加させることが示されました。ここでは、このASDマウスモデルにおいてMWMを次のpERKの免疫組織化学的特性評価のための詳細なプロトコールを提示します。
Protocol
Representative Results
Discussion
– / –マウス、神経発達障害のマウスモデルここでは、たEn2でMWM後の神経活性化を明らかにするためのpERKの免疫組織化学プロトコルを提供します。 – / – WTと比較して変異体たEn2のCA3サブフィールドで検出されたのpERKのレベルを減少させました。異なるCA3サブフィールド、のpERK陽性ニューロンの一般的な増加で観察されたものからではなく、両方の門で検出されたとEN2のGCL …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは支援のためCIBIO（トレント大学）とCNR神経科学研究所の管理スタッフに感謝したいと思います。ジョバンニProvenzanoはFondazione Veronesi（ミラノ、イタリア）からのポスドクフェローシップでサポートされています。この作品は、イタリアの大学研究省（PRIN 2008グラント＃YBに200894SYW2_002とPRIN 2010年から2011年のグラント＃2010N8PBAA_002）、トレント大学（YBにCIBIO起動グラント）とテレソン財団（へグラント＃のGGP13034によって賄われていましたYB）。
Materials
| EthoVision XT 8 | Noldus Information Technology | This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market. | |
| Tempera Paint | Giotto – Fila Group Company | White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze. | |
| Vibratome | Leica | VT1200 | Equivalent models from other companies can be used. |
| 24 well plate | Sigma | CLS3524 | |
| 100% ethanol | Fisher Scientific | A406-20 | Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting. |
| Xylene | VWR | 66004-950 | Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use. |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| PBS | Sigma | P3813-10PAK | |
| ddH2O | |||
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma | H1009-100ML | |
| Normal Goat Serum | Abcam | G9023-10ML | |
| ABC kit Vectastain | Vector Laboratories | PK-6100 | Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix. |
| DAB peroxidase substrate | Vector Laboratories | SK-4100 | Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix. |
| pERK antibody | Cell Signaling Technologies | 4370 | Dilution 1:500 |
| Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody | Vector Laboratories | BA-1000 | Dilution 1:250 |
| SuperFrost Slides | Carl Roth | 1879 | |
| Coverslips | Fisher | 12-548-B | |
| DPX | Sigma | 317616 | Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used. |
| Microscope | Zeiss | Axio Imager.M2 | Equivalent microscope can be used. |
| Adobe Photoshop | Adobe Systems, San Jose, CA | To assemble images. | |
| Image J software | National Institute of Health | Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| SigmaPlot 11.0 | Systat Software Inc. (USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. | |
| Prism 6 | GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA) | Equivalent softwares for statistical analysis can be used. |
References
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