Visualización inmunohistoquímico de hipocampo Neurona Actividad Después espacial aprendizaje en un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico

Summary

Se describe un protocolo de inmunohistoquímica para estudiar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. Este protocolo se puede aplicar a ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

Abstract

La inducción de la quinasa extracelular regulada fosforilada (pERK) es una lectura fiable molecular de la activación neuronal de aprendizaje-dependiente. Aquí se describe un protocolo de inmunohistoquímica Perk para estudiar el perfil de la activación de las neuronas del hipocampo tras la exposición a una tarea de aprendizaje espacial en un modelo de ratón que se caracteriza por déficits cognitivos de origen del desarrollo neurológico. En concreto, se utilizó inmunotinción Perk para estudiar la activación neuronal tras laberinto acuático de Morris (MWM, una tarea de aprendizaje hipocampo-dependiente clásica) en Engrailed-2 knockout (En2 ^{– / -)} ratones, un modelo de trastornos del espectro autista (TEA). En comparación con el de tipo salvaje (WT) controles, En2 ^{– / –} ratones mostraron déficits de aprendizaje espacial significativas en el MWM. Después de MWM, se detectaron diferencias significativas en el número de neuronas Perk-positivas en los subcampos del hipocampo específicas de En2 ^{– / –} ratones, en comparación con los animales WT. Por lo tanto, nuestro protocolo puede detectar diferencias en robustamenteneuronas Perk-positivos asociados con el deterioro de aprendizaje hipocampo-dependiente en un modelo de ratón de los TEA. Más en general, nuestro protocolo se puede aplicar a investigar el perfil de activación de las neuronas del hipocampo en ambos modelos genéticos o farmacológicos de ratón caracterizadas por déficits cognitivos.

Introduction

Trastornos del desarrollo neurológico incluyen un grupo amplio y heterogéneo de trastornos como el síndrome de Down, síndrome de cromosoma X frágil (FXS), el síndrome de Rett, neurofibromatosis, esclerosis tuberosa y ASD, en la que el desarrollo y maduración del sistema nervioso central (SNC) se altera temprana durante el período prenatal ^1. Estas disfunciones del desarrollo cerebral pueden causar profundos efectos, toda la vida en la función motora, lenguaje, aprendizaje y proceso de la memoria. Una plétora de factores genéticos y ambientales han sido implicados en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo durante los últimos años ^2,3. Incluso si los mecanismos moleculares que subyacen al fenotipo clínico siguen siendo desconocidos, los hallazgos mencionados anteriormente han permitido el desarrollo de varios modelos de ratón de estos trastornos. Déficits de aprendizaje y memoria se han identificado en un número de estos modelos de ratón, tales como Tsc1 ^+/-, Tsc2 ^+/-,Nf1 ^+/- y En2 ^{– / –} ratones ^2,4-7. Un reto importante en el campo de los trastornos del desarrollo neurológico es la identificación de los procesos celulares y moleculares que subyacen a la memoria y el aprendizaje de la disfunción. Vías de señalización activadas seleccionados durante el aprendizaje o la memoria pueden inducir la transcripción de genes específicos y en última instancia conducir a la síntesis de novo de proteínas. Genes tempranos inmediatos de activación y de proteínas dependientes (IEGs) modificaciones sinápticas son inducidos rápidamente en las neuronas del cerebro en respuesta a la actividad neuronal y la formación del comportamiento ^8,9.

Las deficiencias en las vías de señalización que implican neurofibromina se han asociado con problemas de aprendizaje en los trastornos del desarrollo neurológico. Neurofibromin es el producto del gen NF1, cuya mutación causa neurofibromatosis tipo 1, un síndrome genético complejo caracteriza por tumores del sistema nervioso, de los retardos y de comportamiento de motor y cognitivo DISAbilidades ^10. Ratones heterocigotos para eliminación Cf1 restringidas a las neuronas inhibitorias muestran déficits en la fase temprana de la potenciación a largo plazo (LTP), así como el aprendizaje espacial comprometido en MWM ^5,11,12. Curiosamente, la deficiencia de NF1 este modelo de ratón conduce a una activación de Ras sobre-señalización en interneuronas inhibidoras durante el aprendizaje, lo que resulta en un aumento de la fosforilación de ERK y finalmente en una mejora anormal de la liberación de GABA a partir de estas neuronas ^5.

Basándose en estos hallazgos, la visualización de la actividad neuronal después de tareas de comportamiento representa una manera de reconstruir circuitos específicos implicados en enfermedades del desarrollo neurológico. El protocolo de inmunohistoquímica descrito aquí tiene como objetivo evaluar y cuantificar los niveles de fosforilación de ERK hipocampo siguientes MWM en un modelo de ratón ASD con déficits cognitivos. MWM es ampliamente utilizado para investigar el aprendizaje espacial dependiente del hipocampo y la memoria en roedores ^13,14 </sarriba>. Decidimos utilizar la fosforilación de ERK como lectura molecular del aprendizaje hipocampo tarea dependiente, ya que ERK ha demostrado tener un papel esencial en el aprendizaje y la memoria formación ^15. Por otra parte, la vía ERK es necesario para dependiente de la experiencia plasticidad en la corteza visual en desarrollo ^16. Finalmente, los ratones que carecen de una de las dos isoformas de ERK (ERK2) en el espectáculo CNS marcados anomalías en los comportamientos cognitivos, emocionales y sociales ^17, lo que indica que la señalización de ERK podría desempeñar un papel crítico en la patogénesis de los trastornos del neurodesarrollo, tales como ASD.

Utilizamos Engrailed 2 nocaut (En2 ^{– / -)} ratones como modelo de trastornos del neurodesarrollo. En2 ^{– / –} ratones muestran características anatómicas y de comportamiento "ASD-like", incluyendo la pérdida de interneuronas del cerebro anterior ^18, la reducción de la expresión de genes relacionados con el ASD ^19, disminución de la sociabilidad, y deterioro de la flexibilidad cognitiva ^6,7,20. Learni espacialng y defectos de memoria, como los detectados en MWM, son especialmente robusto en En2 ^{– / –} ratones ^6,7 y podrían ser relevantes para los deterioros cognitivos observados en pacientes ASD ^21. Por otra parte, hemos demostrado que el aprendizaje espacial deteriorada en MWM se asocia con la reducción de expresión neurofibromina y aumentó los niveles pERK en el hilio del En2 ^{– / –} ratones adultos ^7. Aquí presentamos el protocolo detallado para la caracterización inmunohistoquímica de Perk siguiente MWM en este modelo de ratón TEA.

Protocol

Todos los experimentos se llevaron a cabo de conformidad con la Directiva de la Comunidad Europea 2010/63 / UE y fueron aprobados por el Ministerio de Salud de Italia. 1. Cuidado de Animales, Vivienda y Tratamiento Realizar todos los protocolos experimentales con ratones de acuerdo con las directrices de la respectiva cuidado de los animales institucional. Mantener los animales en un 12 horas de luz / oscuridad ciclo con los alimentos y el agua ad libitum. …

Representative Results

El protocolo descrito aquí fue diseñado para visualizar, por inmunohistoquímica, la expresión de un marcador específico de la actividad de las neuronas del hipocampo después de MWM en un modelo de ratón de trastornos del neurodesarrollo. Todos los datos experimentales que se muestran en este documento se tomaron de nuestro reciente trabajo 7. Se utilizaron obtenidos de apareamientos heterocigotos; camada de la misma edad de adultos (peso = 25-35 g 3-5 meses de edad) – Hombres y mujeres WT y …

Discussion

Aquí, ofrecemos un protocolo de inmunohistoquímica Perk por revelar la activación neuronal después de MWM en En2 ^{– / –} ratones, un modelo de ratón de los trastornos del desarrollo neurológico. Se detectaron niveles disminuidos de Perk en el subcampo CA3 del En2 ^{– / –} mutantes en comparación con WT. A diferencia de lo observado en el subcampo CA3, un aumento general de las neuronas Perk-positivo fue lugar detectarse tanto en hilio y GCL de En2 ^{– / –} ratones en comparación con WT. …

Materials

EthoVision XT 8	Noldus Information Technology		This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint	Giotto – Fila Group Company		White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome	Leica	VT1200	Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene	VWR	66004-950	Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use.
Sodium Azide	Sigma	S2002
PBS	Sigma	P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100	Sigma	T-8787
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009-100ML
Normal Goat Serum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100	Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370	Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope	Zeiss	Axio Imager.M2	Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop	Adobe Systems, San Jose, CA		To assemble images.
Image J software	National Institute of Health		Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0	Systat Software Inc. (USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6	GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.