Immunohistokjemisk Visualisering av hippocampus Neuron aktivitet Etter Spatial læring i en musemodell for nevrologiske lidelser

Summary

Vi beskriver en protokoll immunhistokjemi for å studere profilen til hippocampus neuron aktivering etter eksponering for et romlig læring oppgave i en musemodell, karakterisert ved kognitiv svikt av nevrologisk opprinnelse. Denne protokollen kan brukes på både genetiske eller farmakologiske musemodeller kjennetegnes av kognitiv svikt.

Abstract

Induksjon av fosforylert ekstracellulære regulert kinase (perk) er en pålitelig molekylær avlesning av læring avhengig neuronal aktivering. Her beskriver vi en ekstra fordel immunhistokjemi protokollen for å studere profilen til hippocampus nevron aktivering etter eksponering for en romfølelse oppgave i en musemodell preget av kognitiv svikt av neurodevelopmental opprinnelse. Spesielt har vi brukt Perk immunofarging å studere nerveaktivering følgende Morris vannet labyrint (MWM, en klassisk hippocampus-avhengig læring oppgave) i Engrailed-to knockout (en2 ^{– / -)} mus, en modell av autismespekterforstyrrelser (ASD). Som sammenlignet med villtype (wt) kontroller, EN2 ^{​​- / –} mus viste signifikant romlig læring underskudd i MWM. Etter MWM, var signifikante forskjeller i antall perk-positive nevroner oppdaget i bestemte hippocampus subfields av en2 ^{– / –} mus, sammenlignet med WT dyr. Således kan vår robust protokoll oppdage forskjeller iPerk-positive nevroner knyttet til hippocampus-avhengig læring verdifall i en musemodell for ASD. Mer generelt kan vår protokoll anvendes for å undersøke profilen til hippocampus neuron aktivering i både genetiske og farmakologiske musemodeller karakterisert ved kognitiv svikt.

Introduction

Nevrologiske lidelser omfatter en bred og heterogen gruppe av lidelser som Downs syndrom, skjøre X syndrom (FXS), Retts syndrom, nevrofibromatose, rotknoller sklerose og ASD, hvor utviklingen og modningen av sentralnervesystemet (CNS) er forstyrret tidlig i løpet prenatal perioden ^1.. Disse utviklingshjerneforstyrrelser kan føre til dyptgripende, livslang effekt på motorisk funksjon, språk, læring og hukommelse prosessen. En overflod av genetiske og miljømessige faktorer har vært implisert i patogenesen av nevrologiske lidelser i løpet av de siste årene ^2,3. Selv om de molekylære mekanismer som ligger under den kliniske fenotype er ukjent, har de ovennevnte resultatene er tillatt utviklingen av flere musemodeller for disse lidelsene. Lærings- og hukommelsessvikt har blitt identifisert i en rekke av disse musemodeller som TSC1 ^+/-, TSC2 ^+/-,NF1 ^+/- og en2 ^{– / –} mus ^2,4-7. En viktig utfordring i feltet av nevrologiske lidelser er identifisering av cellulære og molekylære prosesser som ligger til grunn hukommelse og læring dysfunksjon. Utvalgte signalveier aktiveres under læring eller hukommelse kan indusere transkripsjon av spesifikke gener og til slutt føre til de novo proteinsyntesen. Umiddelbare-tidlig gener (IEGs) aktivering og protein-avhengige synaptiske endringer raskt indusert i hjernens nerveceller i respons til neuronal aktivitet og atferdstrening ^8,9.

Underskudd i signalveier som involverer neurofibromin har vært forbundet med svekket læring i nevrologiske lidelser. Neurofibromin er produktet av NF1 genet, mutasjon som forårsaker nevrofibromatose type 1, en kompleks genetisk syndrom karakterisert ved nervesystemet tumorer, atferdsmessige og motor forsinkelser, og kognitiv disahetene ^10. Mus heterozygot for NF1 sletting begrenset til hemmende nerveceller viser underskudd i den tidlige fasen av langsiktig (LTP), samt svekket romfølelse i MWM ^5,11,12. Interessant, NF1 mangel i denne musemodell fører til en over-aktivering av Ras-signal i hemmende interneuroner under læring, noe som resulterer i økt ERK-fosforylering og til slutt i en unormal økning av GABA-frigjøring fra disse neuroner ^5.

Basert på disse funnene, visualisering av neuronal aktivitet etter atferds oppgaver representerer en måte å rekonstruere spesifikke kretser involvert i nevrologiske sykdommer. Den immunhistokjemi protokollen beskrevet her tar sikte på å vurdere og kvantifisere hippocampus ERK fosforyleringsseter nivåer etter MWM i en ASD musemodell med kognitiv svikt. MWM er mye brukt til å undersøke hippocampus avhengig romlig læring og hukommelse hos gnagere ^13,14 </sopp>. Vi velger å bruke ERK-fosforylering som molekylær avlesning av oppgaven avhengig hippocampus læring, siden ERK ble vist å ha en viktig rolle i læring og hukommelse formasjonen ^15. Videre er ERK-reaksjonsveien er nødvendig for erfaring avhengig plastisitet i u visuelle cortex ^16. Endelig mus som mangler en av de to ERK-isoformene (ERK2) i CNS viser markerte uregelmessigheter i kognitive, emosjonelle og sosial oppførsel ^17, noe som indikerer at ERK signale kan spille en avgjørende rolle i patogenesen av nevrologiske forstyrrelser slik som ASD.

Vi brukte Engrailed to knockout (en2 ^{– / -)} mus som en modell for nevrologiske lidelser. En2 ^{– / –} mus viser anatomiske og atferds "ASD-lignende" funksjoner, inkludert tap av forhjerne interneuroner ^18, redusert uttrykk for ASD-relaterte gener ^19, redusert omgjengelighet, og svekket kognitiv fleksibilitet ^6,7,20. Spatial learning og minne defekter, slik som de oppdages i MWM, er spesielt robust i en2 ^{– / –} mus ^6,7 og kan være relevant for kognitive svekkelser observert i ASD pasienter ^21. Videre viste vi at nedsatt romfølelse i MWM er assosiert med redusert neurofibromin uttrykk og økt Perk nivåer i hilus av en2 ^{– / –} voksen mus ^7. Her presenterer vi detaljert protokoll for immunhistokjemisk karakterisering av Perk følgende MWM i denne ASD musemodell.

Protocol

Alle forsøkene ble utført i samsvar med EU-direktiv 2010/63 / EU og ble godkjent av det italienske helsedepartementet. 1. Animal Care, Bolig og behandling Utføre alle eksperimentelle protokoller som bruker mus i samsvar med retningslinjene i de respektive institusjonelle dyr omsorg. Opprettholde dyrene i en 12 timers lys / mørke syklus med mat og vann tilgjengelig ad libitum. Huset musene i grupper på 2-4, i standard størrelse polykarbonat mus bu…

Representative Results

Protokollen er beskrevet her er designet for å visualisere, ved immunhistokjemi, ekspresjon av en spesifikk markør for neuron hippocampus aktivitet etter MWM i en musemodell av nevrologiske lidelser. Alle de eksperimentelle data er vist her ble tatt fra vår siste strikk 7. Mann og kvinne WT og en2 – / – alderstilpassede voksne søsken (3-5 måneder gammel, vekt = 25-35 g) hentet fra heterozygot parringer ble brukt. Tjueto mus (11 per genotype) ble anvendt for MWM. Åtte mus (fire pr genotype) bl…

Discussion

Her gir vi en ekstra fordel immunhistokjemi protokoll for å avsløre neuronal aktivering følgende MWM i en2 ^{– / –} mus, en musemodell for nevrologiske lidelser. Redusert nivå av Perk ble oppdaget i CA3 delfelt av en2 ^{– / –} mutanter sammenlignet med WT. Annerledes enn hva observert i CA3 delfelt, en generell økning av Perk-positive nevroner ble i stedet påvist i både hilus og GCL av en2 ^{– / –} mus sammenlignet med WT. En mulig forklaring på denne trenden motsatt i ERK fosforyleringss…

Materials

EthoVision XT 8	Noldus Information Technology		This software platform is not a requirement – there are many other behavioral softwares on the market.
Tempera Paint	Giotto – Fila Group Company		White and liquid, non toxic. Used to prepare opaque water in the Morris water maze.
Vibratome	Leica	VT1200	Equivalent models from other companies can be used.
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% ethanol	Fisher Scientific	A406-20	Used to make ethanol gradient for dehydration prior to slide mounting.
Xylene	VWR	66004-950	Toxic – to be used under hood. Change xylene every month depending on use.
Sodium Azide	Sigma	S2002
PBS	Sigma	P3813-10PAK
ddH2O
Triton X-100	Sigma	T-8787
Hydrogen Peroxide	Sigma	H1009-100ML
Normal Goat Serum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	Add in a volume of 5 ml of PBS 2 drops of reagent A, mix and then add 2 drops of reagent B and mix.
DAB peroxidase substrate	Vector Laboratories	SK-4100	Add in a volume of 5 ml ddH2O: 2 drops of buffer stock solution and mix; 4 drops of DAB and mix; 2 drops of H2O2 and mix.
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370	Dilution 1:500
Biotinylated Goat Anti-Rabbit IgG Antibody	Vector Laboratories	BA-1000	Dilution 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	Mounting medium for slides. Equivalent mounting medium can be used.
Microscope	Zeiss	Axio Imager.M2	Equivalent microscope can be used.
Adobe Photoshop	Adobe Systems, San Jose, CA		To assemble images.
Image J software	National Institute of Health		Free software can be downloaded at http://rsb.info.nih.gov/ij/
SigmaPlot 11.0	Systat Software Inc. (USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.
Prism 6	GraphPad Software, Inc. (La Jolla, CA, USA)		Equivalent softwares for statistical analysis can be used.