बेड़ा नियंत्रित Polymerization के माध्यम से सप्ताह में तीन घटक फ्लोरोसेंट Glycopolymers की सतही और कुशल तैयारी
Summary
An efficient, three-step synthesis of RAFT-based fluorescent glycopolymers, consisting of glycomonomer preparation, copolymerization, and post-modification, is demonstrated. This protocol can be used to prepare RAFT-based statistical glycopolymers with desired structures.
Abstract
सिंथेटिक glycopolymers विभिन्न जैव रासायनिक और जैव चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्रों में उपयोग किया वाद्य और बहुमुखी उपकरण हैं। प्रतिवर्ती अलावा विखंडन चेन हस्तांतरण का उपयोग अच्छी तरह से नियंत्रित फ्लोरोसेंट सांख्यिकीय glycopolymers का एक सरल और कुशल संश्लेषण का एक उदाहरण (बेड़ा) आधारित polymerization प्रदर्शन किया है। (2-aminoethyl) methacrylamide (AEMA) – संश्लेषण lactobionolactone और एन की प्रतिक्रिया से प्राप्त β-गैलेक्टोज युक्त glycomonomer 2-lactobionamidoethyl methacrylamide की तैयारी के साथ शुरू होता है। 2-Gluconamidoethyl methacrylamide (GAEMA) एक टर्मिनल β-galactoside कमी एक संरचनात्मक अनुरूप के रूप में प्रयोग किया जाता है। (2-hydroxyethyl) स्पेसर के रूप में एक्रिलामाइड, AEMA आगे प्रतिदीप्ति लेबलिंग के लिए लक्ष्य के रूप में, और glycomonomers – एन: निम्न बेड़ा की मध्यस्थता copolymerization प्रतिक्रिया तीन अलग अलग मोनोमर्स शामिल है। जलीय प्रणालियों के सहिष्णु, प्रतिक्रिया में इस्तेमाल किया बेड़ा एजेंट (4-cyanopentanoic एसिड) -4-dithiobenzoate है।कम dispersities (≤1.32), उम्मीद के मुताबिक copolymer रचनाओं, और polymerizations के उच्च reproducibility उत्पादों के बीच मनाया गया। फ्लोरोसेंट पॉलिमर AEMA पर प्राथमिक एमाइन कार्य समूहों को लक्षित Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर के साथ glycopolymers संशोधित करके प्राप्त कर रहे हैं। जिसके परिणामस्वरूप glycopolymers की Lectin बाध्यकारी specificities के विशिष्ट glycoepitope पहचानने lectins के साथ लेपित इसी agarose मोती के साथ परीक्षण द्वारा सत्यापित कर रहे हैं। के रूप में वांछित क्योंकि संश्लेषण की आसानी के लिए, उत्पाद रचनाओं की तंग नियंत्रण और प्रतिक्रिया का अच्छा reproducibility, इस प्रोटोकॉल, विशिष्ट संरचनाओं और रचनाओं के साथ अन्य बेड़ा आधारित glycopolymers की तैयारी की दिशा में अनुवाद किया जा सकता है।
Introduction
पिछले दो दशकों में, सिंथेटिक glycopolymers साथ जांच मान्यता लेक्टिन 1-3 प्रक्रियाओं पर ध्यान केंद्रित है, जो अनुसंधान शामिल है कि संक्रामक तंत्र की जांच में महत्वपूर्ण क्षमता का प्रदर्शन, धीमी गति से लेकिन लगातार विकास से गुजरा है। Multivalent चीनी moieties रखने सिंथेटिक glycopolymers काफी ज्यादा लेक्टिन बाध्यकारी efficacies का प्रदर्शन के बाद से monovalent कार्बोहाइड्रेट की तुलना में, वे glycobiology क्षेत्र 3 में काफी मांग कर रहे हैं। नैदानिक अनुसंधान के क्षेत्र में विशेष रुचि के मानव श्वसन सेल सतहों और श्लेष्मा ग्लाइकोप्रोटीन पर उपलब्ध कार्बोहाइड्रेट के साथ बंधन लेक्टिन की मध्यस्थता बैक्टीरियल चिह्नित करने के लिए फ्लोरोसेंट glycopolymers का इस्तेमाल होता है। प्रारंभिक इन विट्रो अध्ययन में बैक्टीरिया बाध्यकारी परीक्षण में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध polyacrylamide आधारित glycopolymers कार्यरत हैं। इन जांच के अनेक परिणाम आशाजनक से पता चला है, लेकिन दोनों पीओएल में, obtainability, और बहुत कुछ करने के लिए बहुत कुछ भिन्नताओं के बारे में चिंताओं को उठायाymer आणविक वजन और glycoepitope सामग्री। एक किफायती में प्रयोगशाला प्रोटोकॉल संरचना सामग्री, आकार, और बैक्टीरियल lectins को लक्षित सिंथेटिक glycopolymers की पवित्रता का एक संतोषजनक नियंत्रण के लिए प्रदान करेगा जो विकसित किया गया था।
Glycopolymers करने के लिए एक उपयुक्त सिंथेटिक दृष्टिकोण के लिए खोज में, एक अपेक्षाकृत नए polymerization की तकनीक प्रतिवर्ती अलावा विखंडन श्रृंखला-ट्रांसफर (बेड़ा) एजेंटों 4 कार्यरत कि नियंत्रित कट्टरपंथी polymerization का एक प्रकार का उपयोग कर परीक्षण किया गया था। इस तरह बेड़ा अभिकर्मकों हाल ही में कुछ glycopolymer तैयारियों 5-7 में इस्तेमाल किया गया है। अन्य glycopolymer तैयारी प्रोटोकॉल के साथ तुलना में, बेड़ा की मध्यस्थता polymerizations मोनोमर संरचनाओं और स्थितियों की प्रतिक्रिया, जलीय समाधान के साथ संभावित संगतता, और इच्छित पोलीमेरिक उत्पादों 8,9 की कम आकार dispersity की एक किस्म के लिए सहिष्णुता सहित कई फायदे हैं, प्रदर्शित करता है। उल्लेखनीय ब्याज का बेड़ा-बीए की तैयारी के लिए प्रोटोकॉल रहे हैंविशिष्ट कार्यों 10-13 हो सकता है, जिनमें से प्रत्येक अलग मोनोमर्स, की रचनाओं के नियंत्रण की अनुमति SED त्रिकोणीय घटक glycopolymers। हालांकि, पिछले अनुसंधान प्रयासों के दोनों सबसे anomeric लटकन कार्बोहाइड्रेट 10 का अभाव है, या कार्यरत अक्सर सहपॉलिमरों हैं जो सांख्यिकीय पॉलिमर से विभिन्न प्रयोजनों की सेवा जो covalently जुड़ा हुआ homopolymers, से मिलकर बनता है कि सप्ताह में तीन ब्लॉक copolymers में जिसके परिणामस्वरूप polymerizations, कदम रखा, जिसमें मोनोमर के अनुक्रम अवशेष एक सांख्यिकीय नियम 9-13 का पालन करें।
हाल ही में, thiocarbonylthio बेड़ा यौगिक रोजगार (4-cyanopentanoic एसिड) एक जलीय वातावरण में -4-dithiobenzoate के एक समूह की तैयारी विशिष्ट लटकन शर्करा और में अपने आवेदन युक्त रैखिक त्रिकोणीय घटक सांख्यिकीय glycopolymers बेड़ा आधारित लेक्टिन की मध्यस्थता बंधन बैक्टीरियल परीक्षण 14 की सूचना मिली थी। एक दृश्य ढंग से प्रस्तुत इस विधि के समग्र लक्ष्य, सप्ताह में तीन घटक को तैयार हैबेड़ा नियंत्रित copolymerization के माध्यम सांख्यिकीय फ्लोरोसेंट glycopolymers। क्योंकि एक कदम polymerization के प्रोटोकॉल की आसानी के पोलिमर, लंबाई और रचनाओं, और प्रतिक्रिया के उच्च reproducibility पर ठीक नियंत्रण, इस प्रोटोकॉल आसानी से वांछित संरचनाओं के साथ glycopolymers के अन्य बेड़ा आधारित संश्लेषण के लिए लागू किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
एक सरल और कुशल के साथ और एक लटकन कार्बोहाइड्रेट के बिना बेड़ा आधारित त्रि-घटक फ्लोरोसेंट glycopolymers, के लिए प्रोटोकॉल, और एक लेक्टिन बाध्यकारी परीक्षण में उनके उपयोग, इस रिपोर्ट में प्रदर्शन किया है। प्रोटोकॉल glycomonomers LAEMA और GAEMA की तैयारी के साथ शुरू होता है। एक एक कदम बेड़ा नियंत्रित copolymerization के माध्यम से, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य उपज, उम्मीद के मुताबिक मोनोमर संरचना और कम dispersity साथ glycopolymers प्राप्त कर रहे हैं। Carboxyfluorescein succinimidyl एस्टर के साथ glycopolymers के बाद के संशोधन के बाद, जिसके परिणामस्वरूप संबंधित फ्लोरोसेंट लेबल glycopolymer के बंधन में अपनी लेक्टिन बाध्यकारी विशिष्टता के लिए आसानी से परीक्षण योग्य है।
बाद में glycopolymer संश्लेषण में नियोजित किया जा करने के लिए कर रहे हैं कि glycomonomers की प्रारंभिक प्रारंभिक चरणों में, आसानी से उपलब्ध lactobionic एसिड और gluconolactone उपयोग किया गया। सिद्धांत रूप में, जटिल oligosaccharides को मोनोसैक्राइडों से ब्याज की किसी भी कार्बोहाइड्रेट, converte किया जा सकता हैग्लूकोज की C6 पर प्राथमिक हाइड्रॉक्सिल समूह पर लक्ष्य चीनी conjugating द्वारा glycomonomers डी। को कम ग्लूकोज अवशेषों के ऑक्सीकरण, और एक लैक्टोन करने के लिए इसके बाद के निर्जलीकरण के बाद, उत्पाद तो आसानी से हो सकता है इसी glycomonomer के लिए फार्म AEMA पर प्राथमिक एमाइन के साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की। इस मार्ग के आगे उदाहरण हाल ही में एक रिपोर्ट 14 में देखा जा सकता है। यह किसी भी polymerization के कदम की शुरुआत से पहले, MEHQ, एक शक्तिशाली polymerization के अवरोध करनेवाला, उपयोग करने के लिए बस से पहले सभी monomer और glycomonomer तैयारियों से हटा दिया जाना चाहिए कि ध्यान दिया जाना चाहिए। यह आसानी से MEHQ तो तुरंत उच्च उपज में अवरोध करनेवाला से मुक्त उत्पाद वेग -20 डिग्री सेल्सियस पर एसीटोन के साथ इलाज के पास है कि glycomonomer भंग करने के लिए मेथनॉल की न्यूनतम राशि का उपयोग करके पूरा किया है।
किसी भी कट्टरपंथी polymerization योजना में आवश्यक, विस्तार और मोनोमर purities के लिए ध्यान पर जोर दिया जाता है। एक बेड़ा polymerization की प्रणाली की खासियत है के रूप में, यह के होते हैंएक कट्टरपंथी स्रोत, एक बेड़ा अभिकर्मक, एक monomer और विलायक। इस कल्पना की प्रस्तुति में, एक एकल कदम बेड़ा polymerization की प्रणाली एक जलीय घोल में तीन अलग-अलग मोनोमर्स रखने प्रतिक्रिया मिश्रण से उत्पन्न सांख्यिकीय सहपॉलिमरों के उत्पादन पर केंद्रित है कि वर्णित है। दो अलग-अलग बेड़ा की मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं से एक एक लटकन पास है कि एक glycomonomer का इस्तेमाल करता है जो में प्रस्तुत कर रहे हैं, कोई बाध्य कार्बोहाइड्रेट अवशेषों के साथ एक पोलिओल रखने, कार्बोहाइड्रेट टर्मिनस (यानी, β-डी-गैलेक्टोज), और अन्य गैर को कम करने। दोनों बेड़ा की मध्यस्थता प्रतिक्रियाओं के लिए आम एक स्पेसर अणु के रूप में कार्य करता है कि एक विलक्षण हाइड्रॉक्सिल समूह रखने मोनोमर्स थे, और एक और एक एमिनो प्रतिक्रियाशील फ्लोरोफोरे के साथ पोस्ट-संशोधन के लिए एक नि: शुल्क एमाइन रखने।
प्रतिक्रिया मिश्रण और वातावरण में ऑक्सीजन की उपस्थिति के बाद से बेड़ा की मध्यस्थता polymerization के लिए हानिकारक है, के स्तर का पता लगाने के लिए अपने हटाने आसानी से कई फ्रीज ईवा के माध्यम से पूरा किया हैcuate पिघलना चक्र उच्च वैक्यूम के तहत Schlenk ट्यूब प्रतिक्रिया पोत को बनाए रखने।
यह जरूरत के रूप में प्रतिक्रिया में अलग monomers के दाढ़ अनुपात समायोजित किया जा सकता है कि ध्यान दिया जाना चाहिए। इसके अलावा, इस्तेमाल किया बेड़ा एजेंट की राशि अलग से है, जिसके परिणामस्वरूप पॉलिमर की लंबाई 18 से नियंत्रित किया जा सकता है। हालांकि, सर्जक को बेड़ा एजेंट की दाढ़ अनुपात हमेशा उत्पाद की कम dispersity आश्वस्त करने के लिए दो से अधिक होना चाहिए। इन शर्तों के तहत, copolymerization के विकास स्थिर है, और प्रतिक्रिया के reproducibility बहुत अधिक है। यही कारण है कि यह एक कारण उनके अलग polymerization की गति के लिए, एक सांख्यिकीय copolymer के भीतर भाग लेने वाले सभी monomers के पूरी तरह से एक समान वितरण प्राप्त संभावना नहीं है कि कहा जा रहा है। बहुलक के भीतर विभिन्न monomers के वितरण निस्र्पक अभी भी बहुत चुनौतीपूर्ण है।
बाद के संशोधन विधि, यहाँ प्रस्तुत, दोनों सरल और अधिक amenabl हैलेबल glycopolymers 2,11 करने के लिए लागू अन्य प्रोटोकॉल की तुलना में फ्लोरोसेंट लेबल की एक व्यापक चयन का उपयोग करने के लिए ई,। ये पानी में घुलनशील एमाइन प्रतिक्रियाशील fluorophores के कई क्वांटम डॉट्स, biotins, और दूसरों को भी शामिल होगा। संश्लेषित, लेबल glycopolymers के बंधन में specificities आसानी से निरीक्षण जाना जाता बंधन समानताएं साथ lectins उपयोग कर रहे हैं। कोई लटकन चीनी रखने पीएमए-GAEMA एक उपयुक्त नकारात्मक नियंत्रण है। इस मार्ग के माध्यम से तैयार विभिन्न फ्लोरोसेंट लेबल के साथ Glycopolymers सफलतापूर्वक लेक्टिन की मध्यस्थता बैक्टीरियल 14 बंधन की जांच में इस्तेमाल किया गया है। प्रस्तुत हैं, सांख्यिकीय फ्लोरोसेंट glycopolymers की इस सरल और कुशल तैयारी glycobiological अनुसंधान के एक विस्तृत विविधता के लिए महान क्षमता प्रदान करना चाहिए।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Experiment Station Chemical Laboratories of the University of Missouri, and by the Cystic Fibrosis Association of Missouri.
Materials
| Reagent | |||
| Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
| D-Gluconolactone | Sigma-Aldrich | G2164 | |
| N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) | Sigma-Aldrich | 697931 | |
| Orange II sodium salt | Sigma-Aldrich | O8126 | |
| Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) | Sigma-Aldrich | 54050 | Polymerization inhibitor |
| N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) | Polysciences, Inc | 24833-5 | |
| Triethylamine | Fisher Scientific | BP-616 | |
| Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh | Sigma-Aldrich | 10343-U | |
| Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh | Sigma-Aldrich | 217514 | |
| Aluminum oxide, ~150 mesh | Sigma-Aldrich | A1522 | Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I |
| Ninhydrin | Sigma-Aldrich | N4876 | An ethanol solution of 0.2 % ninhydrin was used in the test |
| 4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid | Sigma-Aldrich | 722995 | RAFT agent |
| 4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) | Sigma-Aldrich | 11588 | Polymerization initiator |
| Carboxyfluorescein succinimidyl ester | Life Technologies | C1157 | |
| Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead | Vector Laboratorie | AL-1143 | |
| Solvent | |||
| dH2O | Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm | ||
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461-4 | ACS grade or better |
| Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | ACS grade or better |
| Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | ACS grade or better |
| Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 22705 | ACS grade or better |
| Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | ACS grade or better |
| Equipment | |||
| Dialysis membrane (MWCO: 3,500) | Spectrum Labs | 132720 | |
| Polyethylene glycol analytical standard standard | Sigma-Aldrich | O2393 | |
| Schlenk tube, 1 mL | Quark Glass | Customized | |
| TSK-GEL G4000 PWxl | Tosoh Bioscience | 8022 | Used for GPC analysis of the glycopolymers |
| Empower 3 with GPC/SEC package | Waters Corporation | ||
| Waters Alliance HPLC system | Waters Corporation | Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475) | |
| Avance III 800 MHz NMR Spectrometer | Brucker Corporation | ||
| BX43 fluorescence microscope | Olympus Corporation | Used with FITC filter in the glycopolymer binding test | |
| Rotavap / Rotoevaporator | Heidolph | ||
| Fritted disc funnel | Fisher Scientific | 10-310-109 | |
| Lyophilizer | Labconco | ||
| Immunofluorescence microscope slide | Polysciences | 18357-1 | |
| Revco Ultima Plus -80C Freezer | Thermo Scientific | ||
| Plastic Vacuum Bag and Hand Pump | Ziploc | ||
| Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus | Fisher Scientific | ||
| Vacuum Gauge | Sargent-Welch | ||
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