An efficient, three-step synthesis of RAFT-based fluorescent glycopolymers, consisting of glycomonomer preparation, copolymerization, and post-modification, is demonstrated. This protocol can be used to prepare RAFT-based statistical glycopolymers with desired structures.
Glycopolymers sintetici sono strumenti strumentali e versatili utilizzati in vari campi di ricerca biochimici e biomedici. Un esempio di una sintesi facile ed efficiente glycopolymers statistici fluorescenti ben controllati utilizzando reversibile addizione frammentazione chain-trasferimento (RAFT) polimerizzazione sede è dimostrata. La sintesi inizia con la preparazione di β-galattosio contenenti glycomonomer 2-lactobionamidoethyl metacrilammide ottenuto per reazione del lactobionolactone e N – (2-amminoetil) metacrilammide (Aema). 2-Gluconamidoethyl metacrilammide (GAEMA) è usato come un analogo strutturale manca un terminale β-galactoside. Il seguente reazione di copolimerizzazione RAFT-mediata coinvolge tre differenti monomeri: N – (2-idrossietil) acrilammide come distanziale, Aema come obiettivo per ulteriore etichettatura fluorescenza, e le glycomonomers. Tollerante di sistemi acquosi, l'agente RAFT utilizzato nella reazione è (acido 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate.Bassa dispersities (≤1.32), composizioni copolimero prevedibili, e l'alta riproducibilità delle polimerizzazioni sono state osservate tra i prodotti. Polimeri fluorescenti sono ottenuti modificando i glycopolymers con estere carboxyfluorescein succinimidil mira i gruppi funzionali amminici primari sulla Aema. Specificità lectina legante dei glycopolymers risultanti sono verificati da test con corrispondenti agarosio rivestite con specifici lectine glycoepitope riconoscimento. Grazie alla facilità di sintesi, il controllo stretto delle composizioni di prodotto e la buona riproducibilità della reazione, questo protocollo possono essere tradotti verso preparazione di altri glycopolymers basato RAFT-con strutture e composizioni specifiche, come desiderato.
Negli ultimi due decenni, le indagini con glycopolymers sintetici hanno subito uno sviluppo lento ma continuo, dimostrando un notevole potenziale in esame i meccanismi infettivi che comprendono la ricerca che si concentra sul riconoscimento lectina processi 1-3. Poiché glycopolymers sintetici possiedono frazioni di zucchero polivalenti presentano efficacies lectina vincolante molto più elevati, rispetto ai carboidrati monovalenti, sono di grande richiesta nel campo glycobiology 3. Di particolare interesse per la ricerca clinica è l'uso di glycopolymers fluorescenti per caratterizzare il legame con carboidrati disponibili sulla superficie delle cellule respiratorie umane e glicoproteina mucose batterica lectina-mediata. All'inizio studi in vitro impiegato in commercio glycopolymers basato poliacrilammide-in batteriche prove vincolanti. Molte di queste sonde hanno mostrato risultati promettenti, ma ha sollevato preoccupazioni per quanto riguarda, obtainability, e da lotto a lotto variazioni sia in polpeso molecolare Ymer e contenuti glycoepitope. Un protocollo economico in laboratorio è stato sviluppato che fornirebbe un controllo soddisfacente di contenuti la struttura, le dimensioni, e la purezza di glycopolymers sintetiche destinate lectine batteriche.
Alla ricerca di un approccio sintetico atto a glycopolymers, una tecnica relativamente nuova di polimerizzazione è stata testata utilizzando un tipo di polimerizzazione radicale controllato che ha impiegato oltre reversibile-frammentazione catena di trasferimento (RAFT) agenti 4. Tali reagenti RAFT sono state recentemente utilizzate in alcune preparazioni glycopolymer 5-7. Rispetto ad altri protocolli di preparazione glycopolymer, polimerizzazioni RAFT-mediata dimostrano diversi vantaggi, tra cui la tolleranza ad una varietà di strutture monomeriche e condizioni di reazione, potenzialità compatibilità con le soluzioni acquose, e basso dispersity dimensioni dei prodotti polimerici desiderati 8,9. Di notevole interesse sono i protocolli per la preparazione di RAFT-baglycopolymers tri-componente sed che consente il controllo di composizioni di monomeri diversi, ciascuno dei quali può avere funzioni distinte 10-13. Tuttavia, la maggior parte dei precedenti sforzi di ricerca sia mancavano anomerico carboidrati pendente 10, o impiegati intensificati polimerizzazioni conseguente copolimeri tri-blocco, che consistono di omopolimeri covalentemente legate, che spesso servono scopi diversi polimeri che sono copolimeri statistici in cui la sequenza di monomero residui seguono una regola statistica 9-13.
Recentemente, impiegando il composto RAFT thiocarbonylthio (acido 4-cyanopentanoic) -4-dithiobenzoate in ambiente acquoso, la preparazione di un gruppo di RAFT-basato glycopolymers statistici tri-componente lineari contenenti specifici zuccheri sospensione e loro applicazione in lectina-mediata batterica vincolante test è stato segnalato 14. L'obiettivo generale di questo metodo, presentato in modo visivo, è quello di preparare tri-componenteglycopolymers fluorescenti statistici tramite copolimerizzazione ZATTERA controllata. A causa della facilità del protocollo polimerizzazione di uno stadio, il controllo fine della lunghezza polimero e composizioni, e l'elevata riproducibilità della reazione, questo protocollo può essere facilmente applicato ad altre sintesi basata RAFT-di glycopolymers con strutture desiderati.
Un protocollo facile ed efficiente per glycopolymers fluorescenti basati ZATTERA tri-componente, con e senza un carboidrato pendente, e il loro utilizzo in un test-lectina legante, è dimostrato in questa relazione. Il protocollo inizia con la preparazione di glycomonomers LAEMA e GAEMA. Attraverso un one-step ZATTERA controllato copolimerizzazione, glycopolymers con resa riproducibile, prevedibile composizione monomero e basso dispersity, si ottengono. A seguito di post-modifica della glycopolymers con estere carboxyfluorescein succinimidil, il legame del rispettivo glycopolymer fluorescente marcato risulta è facilmente verificabile per la sua specificità-lectina legante.
Nelle fasi preparative iniziali delle glycomonomers che devono essere impiegati nelle successive sintesi glycopolymer, prontamente disponibili lattobionico e gluconolattone stati utilizzati. In teoria, tutti i carboidrati di interesse, da monosaccaridi a oligosaccaridi complessi, può essere converted per glycomonomers coniugando zucchero destinazione sul gruppo ossidrilico primario C6 di glucosio. Dopo l'ossidazione del residuo di glucosio riduzione, e la sua successiva disidratazione per un lattone, il prodotto può quindi essere facilmente fatto reagire con l'ammina primaria Aema per formare il corrispondente glycomonomer. Ulteriori esempi di questo percorso può essere visto in un recente rapporto 14. Va notato che, prima di iniziare qualsiasi fase di polimerizzazione, MEHQ, un inibitore di polimerizzazione potenti, deve essere rimosso da tutte le preparazioni monomero e glycomonomer appena prima dell'uso. Questo viene facilmente eseguita utilizzando la minima quantità di metanolo per sciogliere il glycomonomer che possiede MEHQ poi trattare immediatamente con acetone a -20 ° C per precipitare il prodotto senza inibitore in alto rendimento.
Indispensabile in ogni schema di polimerizzazione radicale, l'attenzione ai dettagli e monomeri purezze sono enfatizzati. Come è tipico di un sistema di polimerizzazione RAFT, si compone diuna fonte radicali, un reagente RAFT, un monomero e solvente. In questa presentazione visualizzata, un sistema di polimerizzazione RAFT passo singolo è descritto che si concentra sulla produzione di copolimeri statistici generati da una miscela di reazione che possiede tre differenti monomeri in soluzione acquosa. Due reazioni RAFT-mediata separati sono presentati in cui si utilizza un glycomonomer che possiede un pendente, non riducente terminus carboidrati (cioè, β-D-galattosio), e l'altra, in possesso di un poliolo senza residuo carboidrato legato. Comune a entrambe le reazioni RAFT mediata erano monomeri che possiedono un gruppo ossidrile singolare che serve come una molecola distanziale, e un'altra in possesso di una ammina libera per la post-modifica con un fluoroforo ammino-reattiva.
Poiché la presenza di ossigeno nella miscela di reazione e l'ambiente è dannoso per polimerizzazione RAFT-mediata, la sua rimozione a livello di tracce viene facilmente realizzata mediante vari freeze-evacicli cuate-disgelo mantenendo il recipiente di reazione tubo Schlenk sotto vuoto spinto.
Va notato che il rapporto molare di differenti monomeri nella reazione può essere regolato secondo necessità. Inoltre, variando la quantità di agente RAFT utilizzato, la lunghezza dei polimeri risultanti può essere controllato 18. Tuttavia, il rapporto molare dell'agente RAFT di iniziatore deve sempre essere maggiore di due per assicurare il basso dispersità del prodotto. In queste condizioni, l'evoluzione della copolimerizzazione è costante, e la riproducibilità della reazione è molto elevata. Detto questo, è improbabile che si ottiene una distribuzione del tutto uniforme di tutti monomeri partecipanti entro un copolimero statistico, a causa delle loro diverse velocità di polimerizzazione. Caratterizzare la distribuzione dei diversi monomeri all'interno del polimero è ancora molto impegnativo.
Il metodo post-modifica, presentata qui, è al tempo stesso semplice e più amenable l'uso di una più ampia selezione di etichette fluorescenti, rispetto ad altri protocolli applicati a glycopolymers etichetta 2,11. Questi includono molti dei fluorofori ammina reattiva idrosolubili, punti quantici, biotins, e altri. Le specificità di legame dei sintetizzati glycopolymers etichettati sono facilmente verificabili utilizzando lectine con note affinità di legame. PMA-GAEMA possiede senza zucchero ciondolo è un adeguato controllo negativo. Glycopolymers con etichette fluorescenti diversi preparati per questa via sono stati utilizzati con successo in ricerche di lectina-mediata batterica vincolante 14. Come presentato, questa preparazione facile ed efficiente glycopolymers fluorescenti statistici dovrebbe fornire un grande potenziale per una vasta gamma di ricerca glycobiological.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Experiment Station Chemical Laboratories of the University of Missouri, and by the Cystic Fibrosis Association of Missouri.
Reagent | |||
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
D-Gluconolactone | Sigma-Aldrich | G2164 | |
N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) | Sigma-Aldrich | 697931 | |
Orange II sodium salt | Sigma-Aldrich | O8126 | |
Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) | Sigma-Aldrich | 54050 | Polymerization inhibitor |
N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) | Polysciences, Inc | 24833-5 | |
Triethylamine | Fisher Scientific | BP-616 | |
Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh | Sigma-Aldrich | 10343-U | |
Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh | Sigma-Aldrich | 217514 | |
Aluminum oxide, ~150 mesh | Sigma-Aldrich | A1522 | Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I |
Ninhydrin | Sigma-Aldrich | N4876 | An ethanol solution of 0.2 % ninhydrin was used in the test |
4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid | Sigma-Aldrich | 722995 | RAFT agent |
4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) | Sigma-Aldrich | 11588 | Polymerization initiator |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester | Life Technologies | C1157 | |
Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead | Vector Laboratorie | AL-1143 | |
Solvent | |||
dH2O | Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm | ||
Isopropanol | Fisher Scientific | A461-4 | ACS grade or better |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | ACS grade or better |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | ACS grade or better |
Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 22705 | ACS grade or better |
Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | ACS grade or better |
Equipment | |||
Dialysis membrane (MWCO: 3,500) | Spectrum Labs | 132720 | |
Polyethylene glycol analytical standard standard | Sigma-Aldrich | O2393 | |
Schlenk tube, 1 mL | Quark Glass | Customized | |
TSK-GEL G4000 PWxl | Tosoh Bioscience | 8022 | Used for GPC analysis of the glycopolymers |
Empower 3 with GPC/SEC package | Waters Corporation | ||
Waters Alliance HPLC system | Waters Corporation | Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475) | |
Avance III 800 MHz NMR Spectrometer | Brucker Corporation | ||
BX43 fluorescence microscope | Olympus Corporation | Used with FITC filter in the glycopolymer binding test | |
Rotavap / Rotoevaporator | Heidolph | ||
Fritted disc funnel | Fisher Scientific | 10-310-109 | |
Lyophilizer | Labconco | ||
Immunofluorescence microscope slide | Polysciences | 18357-1 | |
Revco Ultima Plus -80C Freezer | Thermo Scientific | ||
Plastic Vacuum Bag and Hand Pump | Ziploc | ||
Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus | Fisher Scientific | ||
Vacuum Gauge | Sargent-Welch |