An efficient, three-step synthesis of RAFT-based fluorescent glycopolymers, consisting of glycomonomer preparation, copolymerization, and post-modification, is demonstrated. This protocol can be used to prepare RAFT-based statistical glycopolymers with desired structures.
Syntetiske glycopolymers er instrumentale og allsidige verktøy som brukes i ulike biokjemiske og biomedisinske forskningsfelt. Et eksempel på en lettvint og effektiv syntese av velkontrollerte fluorescerende statistiske glycopolymers ved hjelp av reversible tilsetning-fragmentering kjedeoverførings (RAFT) -basert polymerisasjonen demonstrert. Syntesen begynner med fremstillingen av β-galaktose-holdige glycomonomer 2-lactobionamidoethyl metakrylamid oppnådd ved omsetning av lactobionolactone og N – (2-aminoetyl) metakrylamid (AEMA). 2-Gluconamidoethyl metakrylamid (GAEMA) benyttes som en strukturell analog mangler en terminal β-galaktosid. Den følgende RAFT-mediert kopolymerisasjonsreaksjonen omfatter tre forskjellige monomere: N – (2-hydroksyetyl) akrylamid som spacer, AEMA som target for videre merking fluorescens, og glycomonomers. Tolerant for vandige systemer, flåten middel som anvendes i reaksjonen er (4-cyanopentansyre) -4-dithiobenzoate.Lave dispersities (≤1.32), forutsigbare kopolymermaterialer, og høy reproduserbarhet polymerisasjonene ble observert blant produktene. Fluorescent polymerer oppnås ved å endre glycopolymers med karboksyfluorescein succinimidylester rettet mot de primære amin funksjonelle grupper på AEMA. Lectin-binding som særpreger de resulterende glycopolymers er verifisert ved å teste med tilhørende agaroseperler belagt med spesifikke glycoepitope erkjenner lektiner. På grunn av den enkle syntese, tett kontroll av produktsammensetninger og god reproduserbarhet av reaksjonen, denne protokollen kan oversettes til fremstilling av andre flåten baserte glycopolymers med spesifikke strukturer og sammensetninger, som ønsket.
I de siste to tiårene, har undersøkelser med syntetiske glycopolymers gått sakte men kontinuerlig utvikling, noe som viser et betydelig potensial i å undersøke smittemekanismer som inkluderer forskning som fokuserer på lektin anerkjennelse behandler 1-3. Siden syntetiske glycopolymers innehar multivalente sukkerdeler utviser mye høyere lectin-binding efficacies, sammenlignet med monovalente karbohydrater, er de av stor etterspørsel i Glycobiology felt 3. Av særlig interesse i klinisk forskning er bruken av fluorescerende glycopolymers å karakterisere lektin-mediert bakteriell binding med karbohydrater som er tilgjengelige på humane luftcelleoverflater og slim-glykoprotein. Tidlig i vitro studier anvendes kommersielt tilgjengelige polyakrylamidprodukter basert glycopolymers i bakterie bindende tester. Flere av disse probene viste lovende resultater, men reist bekymringer om, obtainability, og lot-til-lot variasjoner i både polYmer molekylvekt og glycoepitope innhold. En økonomisk in-laboratoriet protokollen ble utviklet som ville sørge for en tilfredsstillende kontroll av struktur innhold, størrelse og renhet av syntetiske glycopolymers rettet mot bakterielle lektiner.
På leting etter et egnet syntetisk tilnærming til glycopolymers ble en relativt ny polymerisasjonsteknikk testet ved hjelp av en type kontrollert radikalpolymerisering at ansatt reversible tillegg-fragmentering kjedeoverføring (flåte) agenter fire. Slike Raft reagenser har nylig blitt brukt i et par glycopolymer forberedelser 5-7. Sammenlignet med andre glycopolymer fremstillings protokoller, flåte-mediert polymerisasjoner viser flere fordeler, blant annet toleranse for en rekke monomere strukturer og reaksjonsbetingelser, mulige kompatibilitet med vandige oppløsninger, og lav dispersitet størrelsen av de ønskede polymere produkt 8,9. Av bemerkelsesverdige interesse er protokoller for utarbeidelse av RAFT-baaliserte tri-komponent glycopolymers, slik at kontroll av sammensetninger av forskjellige monomerer, som hver kan ha forskjellige funksjoner 10-13. Men de fleste av de tidligere forsknings bestrebelser enten manglet anomere anheng 10 karbohydrater, eller anvendes trappet polymerisasjoner som resulterer i tri-blokk-kopolymerer, som består av kovalent koblede homopolymerer, som ofte tjener forskjellige formål enn statistiske polymerer som er kopolymerer hvori sekvensen av monomeren rester følge en statistisk regel 9-13.
Nylig har anvendelse av den thiocarbonylthio RAFT forbindelse (4-cyanopentansyre) -4-dithiobenzoate i et vandig miljø, ved fremstilling av en gruppe av RAFT-baserte lineære tri-komponent statistiske glycopolymers inneholder bestemte anheng sukkere og deres anvendelse i bakterielle lectin-mediert binding tester ble rapportert 14. Det overordnede målet med denne metoden, presentert på en visuell måte, er å forberede tri-komponentstatistiske fluorescerende glycopolymers via RAFT-kontrollerte kopolymeriseringen. På grunn av den enkle av den ett-trinns polymerisering protokollen, den god kontroll over polymeren lengde og sammensetninger, og høy reproduserbarhet av reaksjonen, denne protokollen kan lett anvendes på andre flåte-baserte synteser av glycopolymers med ønskede strukturer.
En lettvint og effektiv protokoll for RAFT-baserte tri-komponent fluorescerende glycopolymers, med og uten et anheng karbohydrat, og deres anvendelse i et lektin-bindingstest, er vist i denne rapporten. Protokollen starter med utarbeidelse av glycomonomers LAEMA og GAEMA. Gjennom en ett-trinns RAFT-kontrollerte kopolymeriseringen, glycopolymers med reproduserbar yield, forutsigbar monomersammensetningen og lav dispersitet, oppnås. Etter post-modifikasjon av glycopolymers med karboksyfluorescein succinimidylester, binding av det resulterende respektive fluorescensmerkede glycopolymer er lett kan testes for sin lektin-bindende spesifisitet.
I de innledende trinnene av preparative glycomonomers som skal anvendes i de etterfølgende synteser glycopolymer, var lett tilgjengelig laktobionsyre og glukonolakton utnyttet. I teorien, noen karbohydrater av interesse, fra monosakkarider til komplekse oligosakkarider, kan være converted til glycomonomers ved å konjugere målet sukker på den primære hydroksylgruppe på C6 av glukose. Etter oksydasjon av den reduserende glukoserest, og påfølgende dehydrering til et lakton, kan produktet da være lett omsettes med det primære amin på AEMA for å danne den tilsvarende glycomonomer. Ytterligere eksempler på denne ruten kan sees i en fersk rapport 14. Det skal bemerkes at før oppstart av en hvilken som helst polymerisasjonstrinn, MEHQ, en potent polymerisasjonsinhibitor, må fjernes fra alle monomer og glycomonomer preparater like før bruk. Dette oppnås lett ved hjelp av den minimale mengde metanol for å oppløse glycomonomer som besitter MEHQ deretter umiddelbart behandle det med aceton ved -20 ° C for å felle ut inhibitor-frie produkt i høyt utbytte.
Essensielt i enhver radikalpolymerisering ordningen, er fokus på detaljer og monomere renhet vektlagt. Som er typisk for en flåte polymerisasjonssystem, det består avet radikal kilde, en flåte reagens, en monomer og løsningsmiddel. I denne visualisert presentasjonen, er en enkelt-trinns polymerisasjon RAFT system er beskrevet som fokuserer på fremstilling av statistiske kopolymerer som er generert fra en reaksjonsblanding som innehar tre forskjellige monomere i en vandig oppløsning. To separate flåte-medierte reaksjoner er presentert i hvilken man anvender en glycomonomer som besitter en pendel, ikke-reduserende karbohydrat-terminus (dvs. β-D-galaktose), og den andre, som har en polyol med ingen bundne karbohydratrester. Felles for begge flåte-medierte reaksjoner var monomerer som har et flertall hydroksylgruppe som fungerer som et avstandsmolekyl, og en annen besitter en fri amin for post-modifikasjon med en amino-reaktiv fluoroforen.
Siden tilstedeværelsen av oksygen i reaksjonsblandingen og miljø er skadelig å flåte-mediert polymerisasjon, er dens fjerning til spornivåer kan lett oppnås via flere fryse-evaCuate-tine-sykluser under opprettholdelse av Schlenk-rør reaksjonsbeholderen under høyvakuum.
Det bør bemerkes at det molare forhold av forskjellige monomerer i reaksjonsblandingen kan justeres etter behov. Også, ved å variere mengden av RAFT middel, lengden av de resulterende polymerer kan kontrolleres 18. Imidlertid bør det molare forhold av flåten middel initiator alltid være større enn to for å sikre den lave dispersitet av produktet. Under disse betingelser er utviklingen av kopolymerisasjonen jevn, og reproduserbarheten av reaksjonen er svært høy. Når det er sagt, er det lite sannsynlig at man får en helt jevn fordeling av alle monomerer som deltar i en statistisk kopolymer, på grunn av deres forskjellige polymerisasjonsprosesser hastigheter. Karakteriserer fordelingen av forskjellige monomerer i polymeren fremdeles er meget krevende.
Den post-modifikasjon metoden, som presenteres her, er både enklere og mer amenable til bruk av et bredere utvalg av fluorescerende markører, sammenlignet med andre protokoller påføres etiketten glycopolymers 2,11. Disse vil inneholde mange av de vannløselige amin-reaktive fluoroforer, kvanteprikker, biotins, og andre. De bindingsspesifisiteter av de syntetiserte, merket glycopolymers er lett kontrollerbar bruker lektiner med kjente bindingsaffiniteter. PMA-GAEMA innehar ingen anheng sukker er en egnet negativ kontroll. Glycopolymers med ulike fluorescerende etiketter fremstilt via denne ruten har blitt brukt i undersøkelser av lektin-mediert bakteriell binding 14. Som presentert, bør dette lettvint og effektiv fremstilling av statistiske fluorescerende glycopolymers gir et stort potensiale for et bredt spekter av glycobiological forskning.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Experiment Station Chemical Laboratories of the University of Missouri, and by the Cystic Fibrosis Association of Missouri.
Reagent | |||
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
D-Gluconolactone | Sigma-Aldrich | G2164 | |
N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) | Sigma-Aldrich | 697931 | |
Orange II sodium salt | Sigma-Aldrich | O8126 | |
Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) | Sigma-Aldrich | 54050 | Polymerization inhibitor |
N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) | Polysciences, Inc | 24833-5 | |
Triethylamine | Fisher Scientific | BP-616 | |
Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh | Sigma-Aldrich | 10343-U | |
Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh | Sigma-Aldrich | 217514 | |
Aluminum oxide, ~150 mesh | Sigma-Aldrich | A1522 | Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I |
Ninhydrin | Sigma-Aldrich | N4876 | An ethanol solution of 0.2 % ninhydrin was used in the test |
4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid | Sigma-Aldrich | 722995 | RAFT agent |
4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) | Sigma-Aldrich | 11588 | Polymerization initiator |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester | Life Technologies | C1157 | |
Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead | Vector Laboratorie | AL-1143 | |
Solvent | |||
dH2O | Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm | ||
Isopropanol | Fisher Scientific | A461-4 | ACS grade or better |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | ACS grade or better |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | ACS grade or better |
Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 22705 | ACS grade or better |
Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | ACS grade or better |
Equipment | |||
Dialysis membrane (MWCO: 3,500) | Spectrum Labs | 132720 | |
Polyethylene glycol analytical standard standard | Sigma-Aldrich | O2393 | |
Schlenk tube, 1 mL | Quark Glass | Customized | |
TSK-GEL G4000 PWxl | Tosoh Bioscience | 8022 | Used for GPC analysis of the glycopolymers |
Empower 3 with GPC/SEC package | Waters Corporation | ||
Waters Alliance HPLC system | Waters Corporation | Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475) | |
Avance III 800 MHz NMR Spectrometer | Brucker Corporation | ||
BX43 fluorescence microscope | Olympus Corporation | Used with FITC filter in the glycopolymer binding test | |
Rotavap / Rotoevaporator | Heidolph | ||
Fritted disc funnel | Fisher Scientific | 10-310-109 | |
Lyophilizer | Labconco | ||
Immunofluorescence microscope slide | Polysciences | 18357-1 | |
Revco Ultima Plus -80C Freezer | Thermo Scientific | ||
Plastic Vacuum Bag and Hand Pump | Ziploc | ||
Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus | Fisher Scientific | ||
Vacuum Gauge | Sargent-Welch |