An efficient, three-step synthesis of RAFT-based fluorescent glycopolymers, consisting of glycomonomer preparation, copolymerization, and post-modification, is demonstrated. This protocol can be used to prepare RAFT-based statistical glycopolymers with desired structures.
Syntetiska glycopolymers är instrumentella och mångsidiga verktyg som används i olika biokemiska och biomedicinska forskningsområden. Ett exempel på en enkel och effektiv syntes av välkontrollerade fluorescerande statistiska glycopolymers med omvändbar tillsats-fragmente kedje-överföring (RAFT) -baserad polymerisation demonstreras. Syntesen börjar med framställningen av β-galaktos-innehållande glycomonomer 2-lactobionamidoethyl metakrylamid framställd genom reaktion mellan lactobionolactone och N – (2-aminoetyl) metakrylamid (AEMA). 2-Gluconamidoethyl metakrylamid (GAEMA) används som en strukturell analog som saknar en terminal β-galaktosid. Följande RAFT medierad sampolymerisationsreaktion omfattar tre olika monomerer: N – (2-hydroxietyl) akrylamid som distans, AEMA som mål för ytterligare fluorescensmärkning, och glycomonomers. Tolerant mot vattenhaltiga system, Flotten medlet som används i reaktionen är (4-cyanopentansyra) -4-dithiobenzoate.Låga dispersiteter (≤1.32), förutsägbara sampolymerkompositioner och hög reproducerbarhet av polymerisationerna observerades bland de produkter. Fluorescerande polymerer erhålls genom att modifiera glycopolymers med karboxifluorescein succinimidylester inriktning på de primära aminfunktionella grupper på AEMA. Lektin-bindande särdrag hos de resulterande glycopolymers verifieras genom att testa med motsvarande agaroskulor belagda med specifika glycoepitope erkänner lektiner. På grund av den enkla syntesen, den snäva kontrollen av produktkompositionerna och god reproducerbarhet av reaktionen, detta protokoll kan översättas till framställning av andra RAFT baserade glycopolymers med specifika strukturer och kompositioner, såsom önskas.
Under de senaste två decennierna, har undersökningar med syntetiska glycopolymers genomgått långsam men kontinuerlig utveckling, visar en betydande potential i att undersöka smitt mekanismer som inkluderar forskning som fokuserar på lektin erkännande processer 1-3. Eftersom syntetiska glycopolymers besitter multivalenta sockergrupper uppvisar mycket högre lektin-bindande effektiviteter, jämfört med monovalenta kolhydrater, de är av stor efterfrågan i glykobiologi fält 3. Av särskilt intresse i klinisk forskning är användningen av fluorescerande glycopolymers att karakterisera lektin-medierad bakteriell bindning med kolhydrater som finns på mänskliga andningscellytor och slemhinnor glykoprotein. Tidigt in vitro-studier som används kommersiellt tillgängliga polyakrylamid-baserade glycopolymers i bakteriebindningstester. Flera av dessa sönder visade lovande resultat, men uttryckt farhågor om, obtainability, och mycket mot många variationer i både polYmer molekylvikt och glycoepitope innehåll. Ett ekonomiskt i laboratoriet protokoll har utvecklats som skulle ge en tillfredsställande kontroll över strukturen innehåll, storlek och renhet av syntetiska glycopolymers riktar bakteriella lektiner.
I sökandet efter en lämplig syntetisk metod för glycopolymers, var en relativt ny polymerisationsteknik testats med hjälp av en typ av kontrollerad radikalpolymerisation som användes reversibla additions fragmentering kedje-överföring (flotte) medel 4. Sådana RAFT reagens har nyligen använts i ett fåtal glycopolymer beredningar 5-7. Jämfört med andra protokoll glycopolymer beredning, raft medierad polymerisationer visar flera fördelar, bland annat tolerans mot en mängd monomer strukturer och reaktionsbetingelser, potentiell kompatibilitet med vattenhaltiga lösningar, och låg storlek dispersitet av de önskade polymerprodukter 8,9. Av betydande intresse är protokoll för framställning av RAFT-based tri-komponent glycopolymers, vilket möjliggör kontroll av kompositioner av olika monomerer, som var och en kan ha distinkta funktioner 10-13. Dock saknade de flesta av de tidigare forsknings strävanden antingen anomera vidhängande kolhydrater 10 eller användes steg polymerisationer resulterar i tri-segmentsampolymerer, som består av kovalent länkade homopolymerer, som ofta har olika syften än statistiska polymerer, som är sampolymerer i vilka sekvensen av monomer rester följer en statistisk regel 9-13.
Nyligen, som utnyttjar den thiocarbonylthio RAFT föreningen (4-cyanopentansyra) -4-dithiobenzoate i en vattenhaltig miljö, framställningen av en grupp av RAFT-baserade linjära tri-komponent statistiska glycopolymers innehåller specifika vidhängande sockerarter och deras tillämpning i lektin-förmedlad bakteriell bindning tester rapporterades 14. Det övergripande målet med denna metod, som presenteras i en visuell sätt, är att förbereda tri-komponentstatistiska fluorescerande glycopolymers via RAFT kontrollerade sampolymerisation. På grund av lättheten av en-stegs-polymerisation protokoll, den fina kontroll över polymerlängd och kompositioner, samt hög reproducerbarhet av reaktionen, detta protokoll kan lätt tillämpas på andra RAFT baserade synteser av glycopolymers med önskade strukturer.
En enkel och effektiv protokoll för RAFT-baserade tri-komponent fluorescerande glycopolymers, med och utan hänge kolhydrater, och deras användning i en lektin-bindande test, demonstreras i den här rapporten. Protokollet börjar med framställning av glycomonomers LAEMA och GAEMA. Genom ett en-stegs RAFT kontrollerade sampolymerisation, glycopolymers med reproducerbar utbyte, förutsägbar monomerkomposition och låg dispersitet, erhålles. Efter efter modifiering av glycopolymers med karboxifluorescein succinimidylester, bindningen av den resulterande respektive fluorescensmärkt glycopolymer lätt testbar för dess lektin-bindningsspecificitet.
I den inledande preparativa stegen i glycomonomers som skall användas i de efterföljande glycopolymer synteser var lättillgängliga laktobionsyra och glukonolakton utnyttjas. I teorin, alla kolhydrater av intresse, från monosackarider till komplexa oligosackarider kan vara converted till glycomonomers genom att konjugera målet socker på den primära hydroxylgruppen på C6 av glukos. Efter oxidation av den reducerande glukosrest, och dess efterföljande dehydratisering till en lakton, kan produkten sedan lätt reageras med den primära aminen på AEMA att bilda motsvarande glycomonomer. Ytterligare exempel på denna väg kan ses i en färsk rapport 14. Det bör noteras att innan någon polymerisationssteget, MEHQ, en potent polymerisationsinhibitor, måste avlägsnas från alla monomerer och glycomonomer preparat strax före användning. Detta åstadkommes lätt genom att använda den minsta mängd metanol för att upplösa glycomonomer som besitter MEHQ sedan omedelbart behandla det med aceton vid -20 ° C för att fälla den inhibitorfria produkt i högt utbyte.
Essential i varje radikalpolymerisation system, uppmärksamhet på detaljer och monomerer renhet betonas. Som är typiskt för en flotte polymerisationssystem, består aven radikalkälla, en flotte reagens, en monomer och lösningsmedel. I detta synlig presentation, är ett enda steg RAFT polymerisationssystem beskrivs som fokuserar på produktion av statistiska sampolymerer som genereras från en reaktionsblandning som har tre olika monomerer i en vattenlösning. Två separata RAFT-medierade reaktioner presenteras i vilka en utnyttjar en glycomonomer som besitter en vidhängande, icke-reducerande kolhydrat terminalen (dvs., β-D-galaktos), och den andra, som har en polyol utan bunden kolhydratrest. Gemensamt för båda flotte-medierade reaktioner var monomerer med en singulär hydroxylgrupp som fungerar som en spacermolekyl, och en annan som har en fri amin för post-modifiering med en aminreaktiv fluorofor.
Eftersom närvaron av syre i reaktionsblandningen och miljö är skadlig för RAFT-medierad polymerisation, är dess avlägsnande för att spåra nivåer lätt åstadkommas genom flera frysnings-evacuate nings-upptiningscykler under bibehållande av Schlenk-rör reaktionskärl under högt vakuum.
Det skall noteras att molförhållandet av olika monomerer i reaktions kan justeras efter behov. Också, genom att variera mängden av RAFT medel som används, längden av de erhållna polymererna kan kontrolleras 18. Emellertid bör det molära förhållandet av RAFT medlet till initiator alltid vara större än två för att säkerställa låg dispersitet av produkten. Under dessa betingelser, är utvecklingen av sampolymerisationen stadig, och reproducerbarheten av reaktionen är mycket hög. Med detta sagt, är det osannolikt att man erhåller en helt jämn fördelning av alla deltagande monomerer inom en statistisk sampolymer, på grund av deras olika polymerisationsprocesser hastigheter. Characterizing fördelningen av olika monomerer i polymeren är fortfarande mycket utmanande.
Efter modifiering metod, som presenteras här, är både enklare och mer amenable till användningen av ett bredare urval av fluorescerande markörer, jämfört med andra protokoll som tillämpas på etikett glycopolymers 2,11. Dessa skulle omfatta många av de vattenlösliga aminreaktiva fluoroforer, kvantprickar, biotiner, och andra. Bindnings särdragen hos de syntetiserade, märkta glycopolymers lätt verifierbara använder lektiner med kända bindningsaffiniteter. PMA-GAEMA besitter ingen hängande socker är en lämplig negativ kontroll. Glycopolymers med olika fluorescerande märkningar framställda via denna väg har med framgång använts i undersökningar av lektin-medierad bakteriell bindning 14. Som framgår, bör detta enkel och effektiv framställning av statistiska fluorescerande glycopolymers ger stora möjligheter till ett brett utbud av glycobiological forskning.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Experiment Station Chemical Laboratories of the University of Missouri, and by the Cystic Fibrosis Association of Missouri.
Reagent | |||
Lactobionic acid | Sigma-Aldrich | 153516 | |
D-Gluconolactone | Sigma-Aldrich | G2164 | |
N-(2-hydroxyethyl) acrylamide (HEAA) | Sigma-Aldrich | 697931 | |
Orange II sodium salt | Sigma-Aldrich | O8126 | |
Hydroquinone monomethyl ether (MEHQ) | Sigma-Aldrich | 54050 | Polymerization inhibitor |
N-(2-aminoethyl) methacrylamide hydrochloride (AEMA) | Polysciences, Inc | 24833-5 | |
Triethylamine | Fisher Scientific | BP-616 | |
Anion-exchange resin IRN-78 hydroxide-form, 80 mesh | Sigma-Aldrich | 10343-U | |
Cation-exchange resin 50Wx8, 200 mesh | Sigma-Aldrich | 217514 | |
Aluminum oxide, ~150 mesh | Sigma-Aldrich | A1522 | Type WN-6, Neutral, Activity Grade Super I |
Ninhydrin | Sigma-Aldrich | N4876 | An ethanol solution of 0.2 % ninhydrin was used in the test |
4-Cyano-4-(phenylcarbonothioylthio)pentanoic acid | Sigma-Aldrich | 722995 | RAFT agent |
4,4′-Azobis(4-cyanovaleric acid) | Sigma-Aldrich | 11588 | Polymerization initiator |
Carboxyfluorescein succinimidyl ester | Life Technologies | C1157 | |
Erythrina Cristagalli lectin coated agarose bead | Vector Laboratorie | AL-1143 | |
Solvent | |||
dH2O | Produced by Barnstead water purification system, 18 megOhm-cm | ||
Isopropanol | Fisher Scientific | A461-4 | ACS grade or better |
Methanol | Fisher Scientific | A454-4 | ACS grade or better |
Absolute ethanol | Fisher Scientific | BP2818-100 | ACS grade or better |
Dimethylformamide | Sigma-Aldrich | 22705 | ACS grade or better |
Acetone | Fisher Scientific | A929-4 | ACS grade or better |
Equipment | |||
Dialysis membrane (MWCO: 3,500) | Spectrum Labs | 132720 | |
Polyethylene glycol analytical standard standard | Sigma-Aldrich | O2393 | |
Schlenk tube, 1 mL | Quark Glass | Customized | |
TSK-GEL G4000 PWxl | Tosoh Bioscience | 8022 | Used for GPC analysis of the glycopolymers |
Empower 3 with GPC/SEC package | Waters Corporation | ||
Waters Alliance HPLC system | Waters Corporation | Equipped with refractive index detector (Waters 2414) and fluorescence detector (Waters 2475) | |
Avance III 800 MHz NMR Spectrometer | Brucker Corporation | ||
BX43 fluorescence microscope | Olympus Corporation | Used with FITC filter in the glycopolymer binding test | |
Rotavap / Rotoevaporator | Heidolph | ||
Fritted disc funnel | Fisher Scientific | 10-310-109 | |
Lyophilizer | Labconco | ||
Immunofluorescence microscope slide | Polysciences | 18357-1 | |
Revco Ultima Plus -80C Freezer | Thermo Scientific | ||
Plastic Vacuum Bag and Hand Pump | Ziploc | ||
Vacuum Pump, Direct Drive, Maxima C Plus | Fisher Scientific | ||
Vacuum Gauge | Sargent-Welch |