Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki
Summary
This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.
Abstract
Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.
Introduction
Kütle spektrometrisi (MS) kullanmak proteomik deneyler hedefli olmayan (av tüfeği) veya hedeflenen yöntemleri ya kullanmak için dizayn edilebilir. Keşif proteomik genellikle geleneksel veri bağımlı toplama modunu kullanarak, ya da (örneğin, MS E, SWATH) son zamanlarda geliştirilen veri bağımsız tekniklerden birini 1,2 kullanarak, ya aşağıdan yukarıya av tüfeği MS dayanır. Shotgun proteomik yüksek verimli peptit tanımlama ve nispi ölçümü için güçlü bir araçtır, ama mutlak ölçümü için veya proteinlerin küçük tanımlanan setler (~ onlarca) hedefleme için genellikle uygun değildir. En sık hedeflenen proteomik için kullanılan MS yöntemi nedeniyle yüksek hassasiyet, hız ve dinamik aralık 3-5 tepkisini izleme (SRM) seçilir. SRM alternatifleri yüksek çözünürlüklü, tam MS tarama 6 yararlanır paralel reaksiyon izleme içerir.
SRM genellikle nano-akış Rever kullanılarak gerçekleştirilirSED-fazlı yüksek-performanslı sıvı kromatografisi (nano RP-LC) nano-elektrosprey iyonizasyon bağlanmış cihaz üçlü dört kutuplu kütle spektrometresi (qqq-MS) takılmış bir (daha nano-ESI) iyon kaynağı. Tipik bir deneyde, örnek proteinler proteolitik olarak sindirilir ve elde edilen peptitler, kromatografik ayrıldı, desorbe ve iyonize edilebilir. Elde edilen öncül iyonları m / ilk kuadruple (Q1) tarafından filtre z ve çarpışma gazı ile çarpışarak tarafından ikinci kuadropol (q2) parçalanmış bulunmaktadır. Elde edilen fragman, iyonlarıdır m / z-süzüldü üçüncü dört kutuplu (Q3) ve bir dynode ile nicelendirildi. Her bir ön-madde ve fragman iyon çifti bir geçiş olarak ifade edilir ve her bir geçiş belirli bir süre (kalma süresi tipik olarak 2-50 msn) izlenir. LC-SRM sırasında geçişler önceden tanımlanmış bir liste üzerinden qqq-MS döngüleri (görev döngüsü genellikle ≤3 sn olan) ve her bir geçiş kromatogram üretilir.
Alternatif strategProtein ölçümü için ler, tipik olarak bu nokta, blotlar, Western blotlar, ELISA antikor mikrodizileri, ters fazlı protein mikrodizilerinin, mikroakışkan bağışıklık dijital ELISA ve mikroküre bazlı bağışıklık 7 olarak immün kullanımı. En iyi immünodeneyler LC-ARM önemli ölçüde daha fazla duyarlı olabilir ve bağışıklık örnek hacmi LC-SRM 5 önemli ölçüde daha yüksek olabilir. Ancak, gelişmekte olan immünoanalizler pahalı olabilir ve / veya zaman alıcı ve elde edilen analizler hücrenin / doku lizis / homojenizasyon yöntemleri ile uyumsuz, çapraz reaksiyon ve / veya müdahale savunmasız olabilir ve / veya uygun olmayan 5.8 multiplekslemesi için. Bu sorunlardan bazıları antikor ve MS tabanlı teknikler birleştirilmesi ele alınabilir. Örneğin, hedef proteinleri önce proteoliz ve LC-SRM 9-12 immunoprecipitation kullanılarak zenginleştirilebilir. Seçenek olarak ise, SISCAPA tekniği peptid leve de proteolize sonra imüno kullanmaktadırl 13,14. Buna ek olarak stratejiler immunoenrichment için, yüksek bolluk proteinlerin bağışıklık sistemine analitleri 15,16 elüsyona alarak paraziti azaltarak LC-SRM duyarlılığını artırmak için istihdam edilebilir.
MS-bazlı protein ölçümü etiket özgür ve izotop etiketleme (örneğin, metabolik etiketleme, etiketleme kimyasal ve ağır etiketli protein ve peptid iç standartlar) içine de göreli ve mutlak ölçümü ayrılır ve yapılabilir. Etiket serbest teknikler göreli protein ölçümü için yararlı olabilir, ancak kesin mutlak ölçümü için uygun değildir olabilir. Karşılaştırma olarak, etiketleme teknikleri numune hazırlama ve MS varyans ile ilişkili hata azaltmıştır, ve çoğu zaman görece protein miktarının 17 kullanılmaktadır. Örneğin, izotop etiketli proteome (SILAP) standartları, insan serumu 18 LC-ARM üzerinden olası biyolojik belirteçler nispi miktarını etkin kültürlenmiş insan hücre hattı kullanılarak hazırlandı. MS ile Doğru mutlak protein ölçümü saflaştırılmış, sayısal, izotopik olarak etiketlenmiş protein ya da peptid iç standartlar çivili-içine olması MS öncesinde biyolojik örnekler gerektirir. LC-SRM iş akışına ağır izotop etiketli dahili standartların dahil son derece tekrarlanabilir ve laboratuarlar 16,19 arasında transfer olduğu gösterilmiştir mutlak kantifikasyonunu sağlar.
MS ile saf protein ölçümü için izotop etiketli dahili standartlar peptid standartları, katı faz sentezi 20, birleştirilmiş proteaz klivaj peptid standartları 21 oluşan proteinler, ve tam uzunluktaki protein standartlarını 22 kullanılarak hazırlandı bulunmaktadır. Hedef protein kovalent modifikasyon ve eksik numune hazırlama (yani eksik örnek parçalama ve homojenizasyon ve eksik protein solübilizasyon, denatürasyonu, alkilasyon ve proteoliz) doğru kantifikasyon sarsar. İç protein standartlar bu potansiyel sorunların en etkilenecek en az olasıdır, ancak genellikle hazırlamak için en zor bulunmaktadır. Alternatif bir amino- ve karboksi-terminal ana kuşatan kalıntılarını içerecek şekilde tasarlanan çok sayıda dahili peptid standartları kullanılarak her bir hedef protein analiz etmektir. Ne olursa olsun, iç standart türü kullanıldığında bunlar, bu katkılı halinde gereken biyolojik örnekler gibi erken bir noktada mümkün olduğu numune hazırlama sırasında. Ayrıca, birden çok örnek hazırlama teknikleri (örneğin, farklı bir denatürasyon koşulları) test edilmelidir. Birden dik deneysel teknikler (deneysel çapraz doğrulama) kullanımı 23-25 zorluklar çoğu potansiyel kantifikasyon üstesinden gelmek için uygun bir stratejidir.
Proteinlerin LC-SRM miktar geniş bir uygulama yelpazesinde kullanılabilir olan son derece esnek bir tekniktir. Özellikle, bu içindeki peptid ve protein biyolojik işaretleri incelemek için kullanılmıştırBöyle serum, çekirdek biyopsiler ve ince iğne aspiratları 5 klinik örnekler. LC-SRM ayrıca, botulinum nörotoksinlerinin 27 tespit etmek için sinyal yolları 5 içinde protein fosforilasyon dinamikleri ölçmek için ve protein konformasyonuna 28 değişiklikleri ölçmek için, protein kompleksleri 5,26 stokiyometri ölçmek için kullanılmıştır.
Laboratuvarımız kemotaksis yolu simülasyonları gelişimini desteklemek için makrofaj kemotaksisini arabuluculuk sinyal proteinleri ölçmek için LC-SRM kullanıyor. protokol genel şeması (Şekil 1) kesin olmayan hedef peptidleri sıralaması ile başlar. Daha sonra, ham dış peptid standartları sentezlendi ve biyolojik numunelerin nitel analiz için LC-SRM tahlilleri geliştirmek için kullanılır. Biyolojik numune türetilen hedef peptid tespit edilirse, saflaştırılmış ağır etiketli dahili peptid standartları niceliksel LC-ARM hazırlanır. Bu protokol, ac için kullanılabilircurately biyolojik örneklerin çeşitli proteinleri ölçmek ve protein hedeflerinin çok çeşitli araştırmalar desteklemek.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mutlak Protein ölçümü bu biyobelirteç doğrulama ve sinyal iletim yolu modelleme gibi biyomedikal uygulamalarda bir çok farklı aralık için gereklidir. Son zamanlarda, LC-SRM kullanılarak hedeflenen proteomik peptid standart hazırlama, HPLC, qqq-MS ve LC-SRM veri analizi de dahil olmak üzere çok sayıda teknolojilere iyileştirmeler yararlanmıştır. Sonuç olarak, bağışıklık karşı güçlü bir alternatif haline gelmiştir. Immünoanalizler ve / veya uygun değildir multiplekslemesi için, son derece…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
| Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
| Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
| Cell culture EDTA, 500mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media | Michrom Bioresources | PM5/61200/00 | |
| LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media | Michrom Bioresources | PM3/93100/00 | |
| LC coated silica capillary, 50µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
| LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Urea | Sigma | U0631-500g | |
| Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |
References
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
- Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-2394 (2013).
- Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
- Wild, D. . The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , (2013).
- Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
- Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
- Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
- Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
- Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
- Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
- Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
- Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605 (2013).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
- Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
- Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
- Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
- Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. . Peptide synthesis and applications. , (2013).
- Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
- Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2001).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2013).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
- Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
- Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
- Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
- Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A. Does trypsin cut before proline. J Proteome Res. 7, 300-305 (2008).
- Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
- Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
- Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
- Desiere, F., et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res. 34, D655-D658 (2006).
- Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
- Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
- Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
- Alterman, M. A., Hunziker, P. . Amino acid analysis : methods and protocols. , (2012).
- Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
- Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
- Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , (2010).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
- Noble, J. E., Bailey, M. J. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463, 73-95 (2009).
- Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
- Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
- Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
- Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
- Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, S5 (2012).
- Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
- Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
- Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
- Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
- Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. . Mol Cell Proteomics. , .
