תגובה נבחרת ניטור ספקטרומטריית מסה לכימות חלבון מוחלט
Summary
This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.
Abstract
Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.
Introduction
ניסויי proteomic המשתמשים בספקטרומטר מסה (MS) יכולים להיות מתוכננים לשימוש או שאינם ממוקד (רובה) או שיטות ממוקדות. פרוטאומיקה גילוי בדרך כלל מסתמכת על הרובה מלמטה למעלה MS, או על ידי שימוש במצב רכישת הנתונים תלויים מסורתי, או על ידי שימוש באחת מטכניקות הנתונים עצמאיים שפותחו לאחרונה (למשל, MS E, רצועה) 1,2. פרוטאומיקה רובה היא כלי רב עוצמה לזיהוי פפטיד תפוקה גבוהה וכימות יחסי, אבל זה בדרך כלל אינו מתאים לכימות מוחלט או למיקוד קבוצות קטנות, מוגדרים (~ עשרות) של חלבונים. שיטת MS משמשת לרוב לפרוטאומיקה ממוקדת נבחרה תגובת ניטור (SRM) בגלל הרגישות גבוהה, המהירות, והטווח הדינמי שלה 3-5. חלופות לSRM כוללות ניטור תגובה מקביל, שמנצל ברזולוציה גבוהה, סריקה מלאה MS 6.
SRM מבוצע בדרך כלל באמצעות ננו-זרימת reverכרומטוגרפיה SED-שלב ביצועים גבוהים נוזלי (ננו-RP-LC) מכשיר מצמידים את יינון ננו electrospray יון מקור (ננו 'חדשות ארכיאולוגיות) מחובר לספקטרומטר מסת quadrupole משולש (QQQ-MS). בניסוי טיפוסי, חלבוני מדגם proteolytically מתעכלים, ופפטידים וכתוצאה מכך chromatographically מופרדים, desorbed, ומיוננים. היונים מבשר וכתוצאה מכך הם מ '/ z מסונן על ידי quadrupole הראשון (Q1) ומקוטע בquadrupole השני (Q2) על ידי התנגשותם עם גז התנגשות. יוני שבר כתוצאה הם מ '/ בquadrupole השלישי (Q3) ולכמת ידי dynode-מסונן z. כל זוג מבשר ויון בר נקרא מעבר, וכל מעבר הוא פיקוח לתקופה קצובה בזמן (הזמן להתעכב, בדרך כלל 2-50 אלפיות שנייה). במהלך LC-SRM, מחזורי QQQ-MS באמצעות רשימה מוגדרת מראש של מעברים (מחזור העבודה היא בדרך כלל ≤3 שניות), וchromatogram של כל מעבר מיוצר.
strateg האלטרנטיביies לכימות חלבון בדרך כלל להשתמש immunoassays כגון כתמי נקודה, כתמים מערביים, ELISAs, microarrays נוגדן, microarrays חלבון שלב הפוך, immunoassays microfluidic, ELISAs הדיגיטלי, וimmunoassays מבוסס microsphere 7. Immunoassays הטוב ביותר יכול להיות משמעותי יותר רגיש מאשר LC-SRM, ותפוקת מדגם של immunoassays יכולה להיות גבוהה באופן משמעותי מזה של LC-SRM 5. עם זאת, immunoassays פיתוח יכול להיות יקר ו / או זמן רב, וכתוצאה מכך יכולים להיות מבחני פגיעים לתגובה צולבת ו / או הפרעות, עולים בקנה אחד עם תא / תמוגה רקמה / שיטות הומוגניות, ו / או לא נוח לריבוב 5,8. חלק מבעיות אלה ניתן לטפל על ידי צימוד טכניקות antibody- ומבוסס MS. לדוגמא, ניתן להעשיר חלבוני היעד באמצעות immunoprecipitation לפני proteolysis וLC-SRM 9-12. לחלופין, טכניקת SISCAPA מעסיקה immunoprecipitation לאחר proteolysis בleve פפטידl 13,14. בנוסף לimmunoenrichment אסטרטגיות, immunodepletion של חלבוני שפע גבוהים יכול להיות מועסק על מנת להגביר את רגישות LC-SRM על ידי צמצום הפרעות על ידי coeluting analytes 15,16.
כימות חלבון מבוסס MS יכול להיות מחולק לכימות יחסי ומוחלט, וגם לתיוג ויציב ללא תווית איזוטופ (למשל, תיוג חילוף חומרים, תיוג כימי, וחלבון שכותרתו כבד ופפטיד סטנדרטים פנימיים). טכניקות ללא תווית יכולות להיות שימושיות עבור כימות חלבון יחסית, אך אינן מתאימים לכימות מדויק מוחלט. לשם השוואה, בטכניקות תיוג צמצמו שגיאה הקשורות להכנת מדגם ושונות MS, ולעתים קרובות משמשות לכימות חלבון ביחס 17. לדוגמא, proteome איזוטופ היציבה שכותרת סטנדרטים (SILAP) מוכנים באמצעות שורת תאי אדם בתרבית אפשרה כימות יחסי של סמנים ביולוגיים פוטנציאליים באמצעות LC-SRM של סרום אנושי 18. כימות מדויק חלבון מוחלט על ידי MS דורש כי סטנדרטים פנימיים חלבון מטוהר, לכמת, isotopically כותרת או הפפטיד להיות ממוסמרים-לדגימות ביולוגיות לפני טרשת נפוצה. השילוב של סטנדרטים הפנימיים שכותרתו איזוטופ הכבד לעבודת LC-SRM מאפשר כימות מוחלטות שהוכחה להיות לשחזור והעברה בין מעבדות 16,19 מאוד.
הסטנדרטים הפנימיים שכותרתו איזוטופ היציב לכימות חלבון מוחלט על ידי MS כוללים תקני פפטיד מוכנים באמצעות סינתזה מוצקה שלב 20, חלבונים מורכבים מתקני פפטיד בשרשור פרוטאז-cleavable 21, וסטנדרטים חלבון באורך מלא 22. יעד שינוי קוולנטיים חלבון והכנת מדגם חלקי (כלומר, תמוגה שלמה מדגם ולתפעול, וsolubilization חלבון שלם, denaturation, אלקילציה, וproteolysis) יכול לערער כימות מדויק. עמ 'הפנימיהסטנדרטים rotein הם הפחות סביר להיות מושפע מרוב הבעיות הפוטנציאליות אלה, אבל הם בדרך כלל הקשים ביותר להכנה. אלטרנטיבה היא לנתח כל חלבון מטרת שימוש בתקני פפטיד פנימיים רבים אשר נועדו כוללת שאריות ילידי איגוף amino- וcarboxy המסוף. לא משנה איזה סוג של התקן הפנימי מועסק, זה צריך להיות ממוסמר-לדגימות ביולוגיות כבתחילת שלב במהלך הכנת מדגם ככל האפשר. כמו כן, טכניקות מדגם מרובה הכנה (למשל, תנאי denaturation שונים) צריכים להיבדק. השימוש בטכניקות מרובות המאונכות ניסיוניות (אימות צולבת ניסיונית) הוא אסטרטגיה מעשית להתגברות על רוב כימות פוטנציאל אתגרי 23-25.
כימות LC-SRM של חלבונים הוא טכניקה גמישה מאוד שכבר בשימוש במגוון רחב של יישומים. יש לציין, זה כבר נעשה שימוש כדי ללמוד סמנים ביולוגיים פפטיד וחלבונים בתוךדגימות קליניות כגון סרום, ביופסיות ליבה, וaspirates מחט הדק 5. LC-SRM שימש גם כדי למדוד את ההרכב של קומפלקסי חלבונים 5,26, כדי לזהות עצביים בוטולינום 27, לכמת דינמיקת זרחון החלבון בתוך מסלולי איתות 5, ולכמת שינויים בקונפורמציה חלבון 28.
המעבדה שלנו היא באמצעות LC-SRM לכמת את חלבוני האיתות שלתווך chemotaxis מקרופאג כדי לתמוך בפיתוח של סימולציות מסלול chemotaxis. התכנית הכוללת של הפרוטוקול (איור 1) מתחילה בדירוג פפטידים היעד המהוסס. בהמשך לכך, סטנדרטים פפטיד חיצוניים גולמיים מסונתזים ומשמשים לפיתוח מבחני LC-SRM לניתוחים איכותיים של דגימות ביולוגיות. אם פפטיד היעד נגזר מדגם הביולוגי מזוהה, הסטנדרטים פפטיד מטוהרים שכותרתו כבדה פנימיים מוכנים לLC-SRM כמותיים. פרוטוקול זה יכול לשמש כדי ACצורה מדויקת לכמת חלבונים ממגוון רחב של דגימות ביולוגיות, ולתמוך בחקירות במגוון רחב של יעדי חלבון.
Protocol
Representative Results
Discussion
כימות חלבון מוחלט חיוני למגוון מאוד רחב של יישומים ביו-רפואיים כגון אימות סמן ביולוגי ודוגמנות מסלול העברת אותות. לאחרונה, פרוטאומיקה ממוקדת באמצעות LC-SRM נהנתה משיפורים רבים בטכנולוגיות כולל הכנת פפטיד סטנדרטית, HPLC, QQQ-MS, וניתוח נתונים LC-SRM. כתוצאה מכך, היא הפכה חלופה ר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
| Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
| Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
| Cell culture EDTA, 500mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media | Michrom Bioresources | PM5/61200/00 | |
| LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media | Michrom Bioresources | PM3/93100/00 | |
| LC coated silica capillary, 50µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
| LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Urea | Sigma | U0631-500g | |
| Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |
References
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
- Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-2394 (2013).
- Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
- Wild, D. . The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , (2013).
- Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
- Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
- Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
- Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
- Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
- Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
- Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
- Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605 (2013).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
- Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
- Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
- Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
- Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. . Peptide synthesis and applications. , (2013).
- Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
- Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2001).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2013).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
- Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
- Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
- Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
- Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A. Does trypsin cut before proline. J Proteome Res. 7, 300-305 (2008).
- Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
- Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
- Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
- Desiere, F., et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res. 34, D655-D658 (2006).
- Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
- Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
- Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
- Alterman, M. A., Hunziker, P. . Amino acid analysis : methods and protocols. , (2012).
- Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
- Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
- Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , (2010).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
- Noble, J. E., Bailey, M. J. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463, 73-95 (2009).
- Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
- Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
- Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
- Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
- Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, S5 (2012).
- Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
- Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
- Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
- Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
- Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. . Mol Cell Proteomics. , .
