Выбранный мониторинга реакций масс-спектрометрии для абсолютного белка количественной
Summary
This protocol describes how to perform absolute quantification assays of target proteins within complex biological samples using selected reaction monitoring. It was used to accurately quantify proteins of the mouse macrophage chemotaxis signaling pathway. Target peptide selection, assay development, and qualitative and quantitative assays are described in detail.
Abstract
Absolute quantification of target proteins within complex biological samples is critical to a wide range of research and clinical applications. This protocol provides step-by-step instructions for the development and application of quantitative assays using selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry (MS). First, likely quantotypic target peptides are identified based on numerous criteria. This includes identifying proteotypic peptides, avoiding sites of posttranslational modification, and analyzing the uniqueness of the target peptide to the target protein. Next, crude external peptide standards are synthesized and used to develop SRM assays, and the resulting assays are used to perform qualitative analyses of the biological samples. Finally, purified, quantified, heavy isotope labeled internal peptide standards are prepared and used to perform isotope dilution series SRM assays. Analysis of all of the resulting MS data is presented. This protocol was used to accurately assay the absolute abundance of proteins of the chemotaxis signaling pathway within RAW 264.7 cells (a mouse monocyte/macrophage cell line). The quantification of Gi2 (a heterotrimeric G-protein α-subunit) is described in detail.
Introduction
Протеомные эксперименты, использующие масс-спектрометрии (MS) может быть предназначен для использования либо нецелевой (дробовик) или целевых методов. Discovery протеомика в целом опирается на снизу вверх дробовика MS, либо с помощью традиционного способа сбора данных, зависящих от или с помощью одной из недавно разработанных методик обработки данных независимые (например, MS E, валка) 1,2. Ружье протеомики является мощным инструментом для высокой пропускной идентификации пептидов и относительной количественной, но это, как правило, непригодны для абсолютного количественного или с прицелом на небольшие, определенные наборы (~ десятков) белков. Метод МС наиболее часто используется для целевых протеомики выбран реакцию мониторинга (SRM) из-за его высокой чувствительности, скорости и динамическим диапазоном 3-5. Альтернативы SRM включать мониторинг параллельной реакции, которая использует преимущества высокого разрешения, полный MS сканирования 6.
SRM обычно выполняется с использованием нано-REVER потокаSED-фазовой жидкостной хроматографии высокой производительности (нано-RP-LC) инструмента соединен с нано-ионизация электрораспылением (ESI-нано) источник ионов прикреплена к Тройной квадрупольный масс-спектрометр (QQQ-MS). В типичном эксперименте, образцы белки протеолитически перевариваются, и полученные пептиды хроматографически разделены, десорбируют и ионизируется. Полученные ионы-предшественники м / г фильтруется первым квадрупольного (Q1) и фрагментарные во второй квадрупольного (q2) при столкновении их с столкновения газа. Полученные ионы фрагмента м / г фильтруют в третьем квадрупольного (Q3) и количественно с помощью динода. Каждая пара предшественника и ионный фрагмент называется переходом, и каждый переход контролируется в течение определенного периода времени (выдержка времени; обычно 2-50 мс). Во LC-SRM, циклы Qqq-MS через предопределенного списка переходов (рабочий цикл, как правило, ≤3 сек), и хроматограмма каждого перехода производится.
Альтернативная STRATEGх годов для белка количественного обычно используют иммунологические, такие как точечные пятна, пятна, западным ИФА антител микрочипов, обратных белковых чипов фазе микрофлюидных иммунологических, цифровые ИФА и микросфер на основе иммунологических 7. Лучшие иммунологические может быть значительно более чувствительны, чем LC-SRM, и пропускная способность образца иммунологических может быть значительно выше, чем у LC-SRM 5. Тем не менее, развивающиеся иммунологические могут быть дорогими и / или времени, и в результате анализы могут быть уязвимы для кросс-реактивности и / или вмешательства, несовместимы с Cell / тканевой лизис / методов гомогенизации и / или не поддаются мультиплексирование 5,8. Некоторые из этих вопросов могут быть решены путем сочетания антитело и МС-основанные методы. Например, целевые белки могут быть обогащены с помощью иммунопреципитации до протеолиза и LC-SRM 9-12. Кроме того, этот метод использует SISCAPA иммунопреципитации последующее к протеолизу в пептидной Leveл 13,14. В дополнение к immunoenrichment стратегии, immunodepletion высоких белков численности могут быть использованы для повышения чувствительности LC-SRM посредством уменьшения перекрестных помех по coeluting аналитов 15,16.
МС на основе количественное белок может быть разделен на относительное и абсолютное количественное, а также в этикетки свободной и стабильной изотопной метки (например, метаболический маркировки, химической маркировки, и тяжелая-меченого белка и пептида внутренних стандартов). Методы маркировки свободной может быть полезным для относительного количественного белка, но не подходят для точного количественного абсолютной. Для сравнения, методы маркировки уменьшили ошибку, связанную с пробоподготовки и MS дисперсии, и часто используется для определения количества белка по отношению 17. Например, стабильный изотоп помечены протеома (SILAP) стандарты получены с использованием культивируемых клеток линии человеческой включить относительную количественную оценку потенциальных биомаркеров с помощью LC-SRM человеческой сыворотки 18, Точная количественная абсолютное белок РС требует, чтобы очищенная, количественно, изотопно-меченых белков или пептидов внутренние стандарты будут шипами-в биологических образцах до MS. Включение тяжелого изотопа меченых внутренних стандартов в LC-SRM позволяет процесса абсолютное количественное, что, как было показано, чтобы быть хорошо воспроизводимым и передаваться между лабораториями 16,19.
Стабильный изотоп меченые внутренние стандарты для абсолютного количественного белкового MS включают пептидные стандарты подготовлены в твердой фазе синтеза белков, 20, состоящие из сцепленных протеазы расщепл стандартов 21 пептидных и полнометражные стандартов 22 белка с помощью. Целевая модификация белка ковалентной и неполным пробоподготовки (т.е., неполная образец лизис и гомогенизации, и неполное растворение белков, денатурация, алкилирования, и протеолиз), может подорвать точную количественную. Внутренний рrotein стандарты мере могут быть затронуты большинство этих потенциальных проблем, но они, как правило, наиболее трудно получить. В качестве альтернативы можно анализировать каждый целевой белок с использованием нескольких внутренних стандартов пептидные которые предназначены, чтобы включать в себя амино- и карбоксильные-терминал родные фланкирующие остатки. Независимо от типа используемого внутреннего стандарта, следует шипами-в биологических образцах в качестве ранней точки при подготовке пробы, как это возможно. Кроме того, методы подготовки образцов несколько (например, различные условия денатурации) должны быть проверены. Использование нескольких ортогональных экспериментальных методов (экспериментальный кросс-валидации) является жизнеспособной стратегией для преодоления большинства потенциальных количественного проблемы 23-25.
LC-SRM количественное белков является очень гибким метод, который был использован в широком спектре приложений. Следует отметить, что он был использован для изучения пептидных и белковых биомаркеров вклинические образцы, такие как сыворотки, основных биопсии, и тонкой иглой аспирации 5. LC-SRM также используется для измерения стехиометрии белковых комплексов 5,26, для обнаружения нейротоксинов ботулина 27, количественно динамику фосфорилирования белков в сигнальных путей 5 и количественной оценки изменений в конформации белка 28.
Наша лаборатория использует LC-SRM для количественной оценки сигнальных белков, которые обеспечивают макрофагов хемотаксиса, чтобы поддержать развитие хемотаксис пути моделирования. Общая схема протокола (Рисунок 1) начинается с рейтинга предварительные целевые пептиды. Впоследствии, нефть внешние стандарты пептидные синтезированы и использованы для разработки LC-SRM анализов для качественных анализов биологических образцов. Если биологический образец, полученный целевой пептид обнаружено, очищенные тяжелые меченных внутренних стандартов пептидные готовят для количественного LC-SRM. Этот протокол может быть использован для ACcurately количественно белков из широкого спектра биологических образцов, а также поддерживать исследования в самых разнообразных белковых мишеней.
Protocol
Representative Results
Discussion
Абсолютная количественное белок имеет важное значение для очень широкого круга биомедицинских применений, таких как проверка биомаркеров и моделирования затрагивающего пути передачи сигнала. Недавно целевые протеомика, использующие LC-SRM пользовался улучшений многочисленных технол…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This research was supported by the Intramural Research Program of the NIH, National Institute of Allergy and Infectious Diseases.
Materials
| Acetonitrile (ACN), LC-MS grade | Fisher | A955-1 | |
| BCA (bicinchoninic acid) protein assay kit | Fisher | 23235 | |
| Beads for bead beating, zirconia-silica, 0.1mm | BioSpec Products | 11079101z | |
| Bestatin hydrochloride | Sigma | B8385-10MG | |
| Cell culture DMEM (with glucose, without L-glutamine) | Lonza | 12-614F | |
| Cell culture EDTA, 500mM, pH8 | Gibco | 15575 | |
| Cell culture fetal bovine serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11550 | |
| Cell culture L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| Cell culture phosphate buffered saline (PBS) pH 7.4 | Gibco | 10010-049 | |
| Cell culture Trypan Blue viability stain, 0.4% w/v | Lonza | 17-942E | |
| Cellometer Auto T4 cell counter | Nexcelom Bioscience | Cellometer Auto T4 | |
| Cellometer Auto T4 disposable counting chambers | Nexcelom Bioscience | CHT4-SD100-014 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D5545-5G | |
| Formic acid, LC-MS grade, ampules | Fisher | A117-10X1AMP | |
| Hemocytometer, Neubauer-improved, 0.1mm deep | Marienfeld-Superior | 0640030 | |
| HEPES, 1M, pH 7.2 | Mediatech | 25-060-CI | |
| Hydrochloric acid, 37% w/w | VWR | BDH3028-2.5LG | |
| Iodoacetamide | Sigma | I1149-5G | |
| Laser Based Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-2000 | |
| LC Magic C18AQ, 5µm, 200Å, loose media | Michrom Bioresources | PM5/61200/00 | |
| LC Halo ES-C18, 2.7µm, 160Å, loose media | Michrom Bioresources | PM3/93100/00 | |
| LC coated silica capillary, 50µm id | Polymicro Technologies | 1068150017 | |
| LC vial, autosampler, 12x32mm polypropylene | SUN SRI | 200-268 | |
| LC vial screw cap, autosampler, pre-slit PTFE/silicone | SUN SRI | 500-061 | |
| Luciferase, from Photinus pyralis | Sigma | L9506-1MG | |
| Pepstatin A | EMD Millipore | 516481-25MG | |
| pH strips colorpHast (pH 0.0-6.0) | EMD Chemicals | 9586-1 | |
| PhosStop phosphatase inhibitor cocktail | Roche | 04906837001 | |
| RapiGest SF | Waters | 186001861 | |
| Sep-Pak SPE, C18 1ml 100mg cartridge | Waters | WAT023590 | |
| Sep-Pak SPE, extraction manifold, 20 position | Waters | WAT200609 | |
| Sep-Pak SPE, flat-surfaced rubber bulb | Fisher | 03-448-25 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher | S318-500 | |
| SpeedVac vacuum concentrator | Fisher | SPD111V | |
| Trifluoroacetic acid (TFA), LC-MS grade | Fisher | A116-50 | |
| Trypsin, sequencing grade, modified | Promega | V5113 | |
| Tube decapper for Micronic tubes | USA Scientific | 1765-4000 | |
| Tubes, 2ml microcentrifuge, o-ring screw-cap, sterile | Sarstedt | 72.694.006 | |
| Urea | Sigma | U0631-500g | |
| Water, LC-MS grade | Fisher | W6-1 |
References
- Cox, J., Mann, M. Quantitative high-resolution proteomics for data-driven systems biology. Annu Rev Biochem. 80, 273-299 (2011).
- Zhang, Y., Fonslow, B. R., Shan, B., Baek, M. C., Yates, J. R. Protein analysis by shotgun/bottom-up proteomics. Chem Rev. 113, 2343-2394 (2013).
- Boja, E. S., Rodriguez, H. Mass spectrometry-based targeted quantitative proteomics: achieving sensitive and reproducible detection of proteins. Proteomics. 12, 1093-1110 (2012).
- Gillette, M. A., Carr, S. A. Quantitative analysis of peptides and proteins in biomedicine by targeted mass spectrometry. Nat Methods. 10, 28-34 (2013).
- Picotti, P., Aebersold, R. Selected reaction monitoring-based proteomics: workflows, potential, pitfalls and future directions. Nat Methods. 9, 555-566 (2012).
- Lesur, A., Domon, B. Advances in high-resolution accurate mass spectrometry application to targeted proteomics. Proteomics. , (2015).
- Wild, D. . The immunoassay handbook : theory and applications of ligand binding ELISA., and related techniques. , (2013).
- Sturgeon, C. M., Viljoen, A. Analytical error and interference in immunoassay: minimizing risk. Ann Clin Biochem. 48, 418-432 (2011).
- Adrait, A., et al. Development of a Protein Standard Absolute Quantification (PSAQ) assay for the quantification of Staphylococcus aureus enterotoxin A in serum. J Proteomics. 75, 3041-3049 (2012).
- Lin, D., Alborn, W. E., Slebos, R. J., Liebler, D. C. Comparison of protein immunoprecipitation-multiple reaction monitoring with ELISA for assay of biomarker candidates in plasma. J Proteome Res. 12, 5996-6003 (2013).
- Weiss, F., et al. Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research. Biochim Biophys Acta. 1844, 927-932 (2014).
- Yassine, H., et al. Mass spectrometric immunoassay and MRM as targeted MS-based quantitative approaches in biomarker development: potential applications to cardiovascular disease and diabetes. Proteomics Clin Appl. 7, 528-540 (2013).
- Zhao, L., et al. Quantification of proteins using peptide immunoaffinity enrichment coupled with mass spectrometry. J Vis Exp. , (2011).
- Becker, J. O., Hoofnagle, A. N. Replacing immunoassays with tryptic digestion-peptide immunoaffinity enrichment and LC-MS/MS. 4, 281-290 (2012).
- Wasinger, V. C., Zeng, M., Yau, Y. Current status and advances in quantitative proteomic mass spectrometry. Int J Proteomics. 2013, 180605 (2013).
- Abbatiello, S. E., et al. Large-scale inter-laboratory study to develop, analytically validate and apply highly multiplexed, quantitative peptide assays to measure cancer-relevant proteins in plasma. Mol Cell Proteomics. , (2015).
- Rodriguez-Suarez, E., Whetton, A. D. The application of quantification techniques in proteomics for biomedical research. Mass Spectrom Rev. 32, 1-26 (2013).
- Wehr, A. Y., Hwang, W. T., Blair, I. A., Yu, K. H. Relative quantification of serum proteins from pancreatic ductal adenocarcinoma patients by stable isotope dilution liquid chromatography-mass spectrometry. J Proteome Res. 11, 1749-1758 (2012).
- Kennedy, J. J., et al. Demonstrating the feasibility of large-scale development of standardized assays to quantify human proteins. Nat Methods. 11, 149-155 (2014).
- Jensen, K. J., Shelton, P. T., Pedersen, S. L. . Peptide synthesis and applications. , (2013).
- Pratt, J. M., et al. Multiplexed absolute quantification for proteomics using concatenated signature peptides encoded by QconCAT genes. Nat Protoc. 1, 1029-1043 (2006).
- Brun, V., et al. Isotope-labeled protein standards: toward absolute quantitative proteomics. Mol Cell Proteomics. 6, 2139-2149 (2007).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2001).
- . . Guidance for Industry: Bioanalytical Method Validation. , (2013).
- Carr, S. A., et al. Targeted peptide measurements in biology and medicine: best practices for mass spectrometry-based assay development using a fit-for-purpose approach. Mol Cell Proteomics. 13, 907-917 (2014).
- Ori, A., Andres-Pons, A., Beck, M. The use of targeted proteomics to determine the stoichiometry of large macromolecular assemblies. Methods Cell Biol. 122, 117-146 (2014).
- Rosen, O., Feldberg, L., Gura, S., Zichel, R. A new peptide substrate for enhanced botulinum neurotoxin type B detection by endopeptidase-liquid chromatography-tandem mass spectrometry/multiple reaction monitoring assay. Anal Biochem. , (2015).
- Feng, Y., et al. Global analysis of protein structural changes in complex proteomes. Nat Biotechnol. 32, 1036-1044 (2014).
- MacLean, B., et al. Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments. Bioinformatics. 26, 966-968 (2010).
- Mohammed, Y., et al. PeptidePicker: a scientific workflow with web interface for selecting appropriate peptides for targeted proteomics experiments. J Proteomics. 106, 151-161 (2014).
- Rodriguez, J., Gupta, N., Smith, R. D., Pevzner, P. A. Does trypsin cut before proline. J Proteome Res. 7, 300-305 (2008).
- Min, X. J., Butler, G., Storms, R., Tsang, A. OrfPredictor: predicting protein-coding regions in EST-derived sequences. Nucleic Acids Res. 33, W677-W680 (2005).
- Lam, H., et al. Building consensus spectral libraries for peptide identification in proteomics. Nat Methods. 5, 873-875 (2008).
- Craig, R., Cortens, J. P., Beavis, R. C. Open source system for analyzing, validating, and storing protein identification data. J Proteome Res. 3, 1234-1242 (2004).
- Desiere, F., et al. The PeptideAtlas project. Nucleic Acids Res. 34, D655-D658 (2006).
- Vizcaino, J. A., et al. The PRoteomics IDEntifications (PRIDE) database and associated tools: status in 2013. Nucleic Acids Res. 41, D1063-D1069 (2013).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports–principles and applications. J Immunol Methods. 267, 13-26 (2002).
- Ong, S. E., Kratchmarova, I., Mann, M. Properties of 13C-substituted arginine in stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC). J Proteome Res. 2, 173-181 (2003).
- Mant, C. T., et al. HPLC analysis and purification of peptides. Methods Mol Biol. 386, 3-55 (2007).
- Alterman, M. A., Hunziker, P. . Amino acid analysis : methods and protocols. , (2012).
- Maclean, B., et al. Effect of collision energy optimization on the measurement of peptides by selected reaction monitoring (SRM) mass spectrometry. Anal Chem. 82, 10116-10124 (2010).
- Nesvizhskii, A. I. A survey of computational methods and error rate estimation procedures for peptide and protein identification in shotgun proteomics. J Proteomics. 73, 2092-2123 (2010).
- Tabb, D. L., Friedman, D. B., Ham, A. J. Verification of automated peptide identifications from proteomic tandem mass spectra. Nat Protoc. 1, 2213-2222 (2006).
- Freshney, R. I. . Culture of animal cells : a manual of basic technique and specialized applications. , (2010).
- Oberg, A. L., Vitek, O. Statistical design of quantitative mass spectrometry-based proteomic experiments. J Proteome Res. 8, 2144-2156 (2009).
- Noble, J. E., Bailey, M. J. Quantitation of protein. Methods Enzymol. 463, 73-95 (2009).
- Kiser, J. Z., Post, M., Wang, B., Miyagi, M. Streptomyces erythraeus trypsin for proteomics applications. J Proteome Res. 8, 1810-1817 (2009).
- Reiter, L., et al. mProphet: automated data processing and statistical validation for large-scale SRM experiments. Nat Methods. 8, 430-435 (2011).
- Abbatiello, S. E., Mani, D. R., Keshishian, H., Carr, S. A. Automated detection of inaccurate and imprecise transitions in peptide quantification by multiple reaction monitoring mass spectrometry. Clin Chem. 56, 291-305 (2010).
- Callister, S. J., et al. Normalization approaches for removing systematic biases associated with mass spectrometry and label-free proteomics. J Proteome Res. 5, 277-286 (2006).
- Karpievitch, Y. V., Dabney, A. R., Smith, R. D. Normalization and missing value imputation for label-free LC-MS analysis. BMC Bioinformatics. 13, S5 (2012).
- Oh, S., Kang, D. D., Brock, G. N., Tseng, G. C. Biological impact of missing-value imputation on downstream analyses of gene expression profiles. Bioinformatics. 27, 78-86 (2011).
- Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A., Fraser, I. D. Systems biology in immunology: a computational modeling perspective. Annu Rev Immunol. 29, 527-585 (2011).
- Futran, A. S., Link, A. J., Seger, R., Shvartsman, S. Y. ERK as a model for systems biology of enzyme kinetics in cells. Curr Biol. 23, R972-R979 (2013).
- Krokhin, O. V. Sequence-specific retention calculator. Algorithm for peptide retention prediction in ion-pair RP-HPLC: application to 300- and 100-A pore size C18 sorbents. Anal Chem. 78, 7785-7795 (2006).
- Manes, N. P., Angermann, B. R., Koppenol-Raab, M., An, E., Sjoelund, V. H., Sun, J., Ishii, M., Germain, R. N., Meier-Schellersheim, M., Nita-Lazar, A. Targeted Proteomics-Driven Computational Modeling of Macrophage S1P Chemosensing. . Mol Cell Proteomics. , .
