Instilación y Fijación Métodos Útiles en pulmón de ratón Cancer Research
Summary
El objetivo de este trabajo es describir métodos sencillos que ayudarán en gran medida en la configuración y el análisis de los pulmones de ratones con cáncer de pulmón u otras patologías. Presentamos 3 protocolos para llevar a cabo simple y fiable instilaciones de pulmón, fijación, y mediciones de volumen pulmonar.
Abstract
La capacidad de infundir agentes vivos, células o productos químicos directamente en el pulmón sin herir o matar a los ratones es una herramienta importante en la investigación del cáncer de pulmón. Aunque hay un número de métodos que se han publicado que muestra cómo intubar ratones para las mediciones de función pulmonar, ninguno es sin problemas potenciales para la instilación traqueal rápida en grandes cohortes de ratones. En el presente trabajo, un método sencillo y rápido se describe que permite a un investigador para llevar a cabo tales instilaciones de una manera eficiente. El método no requiere de herramientas especiales o iluminación y se puede aprender con muy poco práctica. Se trata de anestesiar un ratón, haciendo una pequeña incisión en el cuello para visualizar la tráquea, y después la inserción de un catéter intravenoso directamente. La pequeña incisión se cierra rápidamente con adhesivo tisular, y los ratones se les permite recuperarse. Un estudiante calificado o técnico pueden hacer instilaciones a una tasa promedio de 2 min / ratón. Una vez tque esté establecido el cáncer, hay con frecuencia una necesidad de un análisis histológico cuantitativo de los pulmones. Tradicionalmente patólogos generalmente no se molestan en estandarizar la inflación pulmonar durante la fijación, y los análisis a menudo se basan en un sistema de puntuación que puede ser muy subjetiva. Si bien esto puede en algún momento ser lo suficientemente adecuada para las estimaciones brutas del tamaño de un tumor de pulmón, cualquier cuantificación estereológicos adecuada de la estructura de pulmón o células requiere un procedimiento de fijación reproducible y la medición del volumen pulmonar subsiguiente. Aquí se describen los procedimientos fiables simples, tanto para la fijación de los pulmones bajo presión y luego medir con precisión el volumen pulmonar fijo. El único requisito es una balanza de laboratorio que es precisa en un rango de 1 mg-300 g. Los procedimientos que aquí se presentan de este modo podrían mejorar en gran medida la capacidad de crear, tratar y analizar los cánceres de pulmón en ratones.
Introduction
Por una serie de razones, cáncer de pulmón no ha sido ampliamente estudiado en el ratón. Una razón para esto es que el acceso a los pulmones es muy difícil in vivo, y el análisis cuantitativo de los pulmones fijos no se hace comúnmente. Los métodos descritos en este documento están diseñadas para remediar esta situación. Los objetivos de este documento son para describir métodos sencillos que ayudarán en gran medida en la configuración y el análisis de los pulmones de ratones con cáncer de pulmón u otras patologías. Aunque ninguno de estos enfoques son totalmente nuevo, que no se han presentado juntos como métodos independientes de la forma simplificada como se describe aquí.
Ha habido un número de manuscritos que han descrito métodos para la intubación del pulmón de ratón principalmente con el propósito de hacer la función pulmonar de repetición o lavado broncoalveolar en ratones individuales en estudios longitudinales. Dado que el papel original, ha habido varios otros papeles que han descrito diferentes enfoques para mouse intubación 1 -9. Si bien todos estos métodos se pueden utilizar con éxito, por lo general requieren un entrenamiento considerable y no son a menudo sin una tasa de fracaso no trivial. Además, con el fin de llevar a cabo mediciones de la función pulmonar, la cánula tiene que encajar herméticamente la tráquea lo suficiente para que no haya fugas de aire. Sin embargo, otro uso práctico para la intubación es para administrar agentes específicos (células de cáncer u otros insultos) o fármacos terapéuticos directamente al pulmón. Tal procedimiento no requiere una cánula de ajuste apretado ni ningún equipo sofisticado de la función pulmonar. La novela característica de este método se muestra aquí implica un procedimiento quirúrgico menor que permite que la intubación sin ninguna posibilidad de la cánula de entrar en el esófago. Este enfoque simple permite la intubación exitosa con relativamente poca formación o experiencia. Nada menos que 30 ratones / hr pueden ser tratados con este enfoque con una tasa de fracaso cercanos a cero.
Una vez tque los ratones están listos para ser sacrificados, los pulmones lesionados o cancerosas luego se puede quitar para histológico y análisis patológico. Sin embargo, con el fin de cuantificar correctamente las variables histológicas para la comparación con otros pulmones, es esencial para estandarizar los procedimientos de fijación y cuantificar adecuadamente el volumen pulmonar fijo 10. En este trabajo se describe en detalle los procedimientos simples que permiten a los procedimientos de fijación estandarizados, así como una manera de medir el volumen pulmonar fijo. El volumen es una métrica esencial en la cuantificación de la histología, ya que sin dicha determinación de volumen, sólo densidades relativas se pueden medir 10. Una vez que se conoce el volumen de pulmón, sin embargo, las mediciones absolutas de células y otras mediciones estructurales en el pulmón pueden ser cuantificados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los procedimientos descritos aquí tienen varias ventajas. En primer lugar el equipo requerido es sencillo y barato. En segundo lugar, la intubación puede hacerse rápidamente con pocos errores. En tercer lugar, la capacidad de fijar los pulmones a una presión constante, y luego medir el volumen pulmonar fijo permite la cuantificación adecuada de estructuras o células en el pulmón 10.
Una desventaja posible a la intubación es la cirugía menor. Esto puede limitar la capacida…
Materials
| Laboratory Balance | Ohaus | Adventurer Pro Model AV 313 | Other balances can be used if they have a range of 1 – 300g |
| 20 g Luer intravenous catheter | Insylte | Several other possible vendors, e.g., Jelco Optiva | |
| 500 mL laboratory bottle | Various | Several other possible vendors |
References
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