Cellules T Capturez bactéries par Transinfection de cellules dendritiques
Summary
Voici un protocole est présenté pour mesurer la capture bactérienne par les cellules T CD4 + qui se produit lors de la présentation de l'antigène par les cellules dendritiques transinfection de pré-infectées (DC). Nous montrons comment effectuer les mesures nécessaires: l'isolement de cellules primaires, infection de DC, DC / T la formation de conjugués de la cellule, et la mesure des bactérienne transfection de cellules T.
Abstract
Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.
Introduction
Quand un agent pathogène infecte son hôte, il ya généralement une activation des réponses immunitaires innées et adaptatives, nécessaires à la clairance bactérienne. L'immunité innée est la première ligne de défense qui empêche la plupart des infections. L'immunité innée distinguer dans un des éléments précis de façon qui sont conservés parmi les grands groupes de micro-organismes (motifs moléculaires associés à des pathogènes, PAMP) 1. Les mécanismes de l'immunité innée sont les barrières physiques telles que la peau, les barrières chimiques (des peptides antimicrobiens, lysozyme) et les leucocytes innées, qui incluent les phagocytes (macrophages, les neutrophiles et les cellules dendritiques), les mastocytes, les éosinophiles, les basophiles et les cellules tueuses naturelles 2. Ces cellules identifier et éliminer les agents pathogènes, soit en les attaquant par contact ou par phagocytose, qui comprend pathogène engloutissant et le meurtre. Ce système ne permet pas de défense à vie, contrairement à l'immunité adaptative, qui confèrent une mémoire immunologique contre pathogens. Le système immunitaire adaptatif est la deuxième ligne de défense et est capable de reconnaître et de réagir à des antigènes spécifiques de multiples microbienne et des substances non-microbiennes 3. Les principaux composants du système immunitaire adaptatif sont les lymphocytes, qui incluent les cellules B et T. Les cellules B sont impliqués dans la réponse humorale, sécrétant des anticorps contre des agents pathogènes ou de protéines exogènes. Cependant, les cellules T représentent l'immunité à médiation cellulaire, la modulation de la réponse immunitaire ou la sécrétion des cytokines tuer les cellules infectées par des agents pathogènes 4.
Les cellules présentant l'antigène (CPA), notamment les cellules dendritiques ou les macrophages, les constituants du système immunitaire inné, capables de reconnaître les agents pathogènes de phagocytent et des composants bactériens de processus en antigènes, qui sont présentés à la surface des cellules par le complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) 7.5. Après APC ont phagocyté pathogènes, ils migrent habituellement dans les ganglions lymphatiques, la vidange où ils interagissent avec Tcellules. Les lymphocytes T peuvent reconnaître des complexes peptide-CMH spécifiques par leurs récepteurs de lymphocytes T. La synapse immunologique (SI) a lieu dans l'interface entre un antigène APC-chargé et une présentation de l'antigène des lymphocytes pendant 8,9. Certaines bactéries peuvent survivre phagocytose et de diffuser systématiquement au sein des APC. Dans cette perspective, les APC infectés servent de réservoirs bactériens ou «chevaux de Troie» qui facilitent la propagation bactérienne 10. Le contact intime entre les APC et les lymphocytes qui ont lieu au cours de la formation IS fonctionnent également comme une plate-forme pour l'échange d'une partie des membranes, le matériel génétique et les exosomes et peut être détourné pour certains virus pour infecter les cellules T; ce processus est appelé transinfection 11-13.
Certaines bactéries pathogènes (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica et Shigella flexneri) peuvent envahir les lymphocytes T in vivo et modifier leur comportement 14-16. Nous avonsrécemment décrits que les lymphocytes T sont également capables de capturer les bactéries par transinfection de cellules dendritiques préalablement infectées (PED) au cours de la présentation de l'antigène 16. T capter cellule bactérienne par transinfection extrêmement plus efficace (1,000-4,000x) que les infections directes. T pathogène des cellules de capture et des bactéries non pathogènes, indiquant que transinfection est un processus piloté par les cellules T. Il est frappant, transinfected T (TIT) cellules tuées rapidement les bactéries capturées et ont fait plus efficacement que les phagocytes professionnels 16. Ces résultats, qui cassent un dogme de l'immunologie, montrent que les cellules de l'immunité adaptative peuvent exécuter des fonctions qui étaient prétendument exclusif de l'immunité innée. En outre, nous avons montré que les cellules de Tit sécrètent de grandes quantités de cytokines pro-inflammatoires et protéger contre les infections bactériennes in vivo.
Ici, nous présentons les différents protocoles utilisés pour étudier le processus de transinfection bactérienne dansun modèle de souris. Ce modèle est basé sur l'utilisation de cellules T CD4 + à partir de souris transgéniques OTII, qui portent un TCR spécifique de peptide OVA 323-339 de (OVAp) dans le cadre de I-Ab 17 qui interagissent spécifiquement avec os bactérienne infectée marrow- PED dérivés (BMDCs) 18,19 chargés de OVAp, formant des synapses immunitaires stables.
T transinfection cellulaire peut être visualisée et suivie par microscopie de fluorescence. En outre, la cytométrie en flux peut être utilisé pour détecter les cellules infectées en tirant parti de la fluorescence émise par des bactéries exprimant la protéine fluorescente verte (GFP) 16,20. En outre, T transinfection cellulaire peut être quantifiée par une approche plus sensible, le test de survie gentamicine qui permet la mesure d'un grand nombre d'événements. La gentamicine est un antibiotique qui ne peuvent pas pénétrer dans les cellules eucaryotes. Par conséquent, en utilisant cet antibiotique permet la différenciation des bactéries intracellulaires qui a survécu à l'ajout fr antibiotiqueceux extracellulaires om qui ont été tués 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cellules T ou lymphocytes T sont un type de leucocytes qui jouent un rôle central dans l'immunité à médiation cellulaire et appartiennent à la 26 réponse immunitaire adaptative. Les cellules T sont réfractaires à être infectés in vitro mais certains rapports indiquent qu'ils peuvent être infectés in vivo 14,15. Les contacts intimes de cellules APC et T au cours de synapse immunologique servent de plates-formes d'échange de matériel biologique 13,</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).
Materials
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | — | |
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | — |
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