תאי T ללכוד חיידקים על ידי Transinfection מתאים דנדריטים
Summary
הנה פרוטוקול מוצג למדוד לכידת חיידקים על ידי תאי CD4 + T אשר מתרחש במהלך מצגת אנטיגן באמצעות transinfection מהתאים נגועים מראש דנדריטים (DC). אנו מראים כיצד לבצע את הצעדים הדרושים: בידוד של תאים ראשוניים, של היווצרות זיהום המצומד תא DC, DC / T, ומדידה של transfection תא T חיידקים.
Abstract
Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4+ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4+ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.
Introduction
כאשר הפתוגן מדביק המארח שלה, בדרך כלל יש הפעלה של המערכת החיסונית המולדת ובעלי כושר הסתגלות, הכרחי לקבלת אישור בקטריאלי. חסינות מולדת היא קו הגנה הראשון המונע הזיהומים ביותר. חסינות מולדת להבחין באלמנטים מדויקים דרך שהשתמרו בקרב קבוצות רחבות של מיקרואורגניזמים (הקשורים דפוסים מולקולריים הפתוגן, PAMPS) 1. המנגנונים של מערכת חיסון מולדת כוללים מחסומים פיזיים כגון עור, מחסומי כימיקלים (פפטידים מיקרוביאלית, יזוזים) וכדוריות דם לבנות המולדים, הכוללים את phagocytes (מקרופאגים, נויטרופילים, ותאים דנדריטים), תאי פיטום, אאוזינופילים, בזופילים, ותאי הרג טבעיים 2. תאים אלה לזהות ולחסל פתוגנים, בין אם על ידי תוקף אותם באמצעות מגע או באמצעות phagocytosis, הכולל מחולל האופפת והרג. מערכת זו אינה מאפשרת הגנה לכל החיים, בניגוד לחסינות אדפטיבית, המעניק זיכרון חיסוני כנגד עמ 'athogens. המערכת החיסונית אדפטיבית היא קו הגנה השני, והוא מסוגל לזהות ולהגיב לאנטיגנים ספציפיים של חיידקים מרובים וחומרים שאינם חיידקים 3. המרכיבים העיקריים של המערכת החיסונית אדפטיבית הם לימפוציטים, הכוללים תאי B ו- T. תאי B מעורבים בתגובת הלחות, מפריש נוגדנים נגד פתוגנים או חלבונים אקסוגניים. עם זאת, תאי T מייצגים את חסינות התא בתיווך, ויסות התגובה החיסונית עם הפרשת ציטוקינים או תאים נגועים בפתוגן הרג 4.
תאי הצגת אנטיגן (נגמ"שים) כוללים תאים דנדריטים או מקרופאגים, מרכיבים של מערכת החיסון המולדת, יכול לזהות פתוגנים phagocytose ורכיבי חיידקי תהליך לאנטיגנים, המוצגים על פני התא על ידי histocompatibility סרן מורכב (MHC) 5-7. לאחר נגמ"שים שphagocytized פתוגנים, הם בדרך כלל להעביר לבלוטות הלימפה ניקוז, שבו הם מתקשרים עם Tתאים. לימפוציטים מסוג T יכול לזהות מתחמי פפטיד-MHC ספציפיים על ידי קולטני תאי T שלהם. סינפסה החיסונית (IS) מתרחשת בממשק שבין APC-עמוס אנטיגן והלימפוציטים במהלך מצגת אנטיגן 8,9. חיידקים מסוימים יכולים לשרוד phagocytosis ולהפיץ באופן שיטתי בתוך נגמ"שים. בתצוגה זו, נגמ"שים נגועים לשמש כמאגרי חיידקים או "סוסים טרויאניים" המאפשרים התפשטות חיידקי 10. קשר האינטימי בין נגמ"שים וימפוציטים שיתקיימו במהלך ההיווצרות גם לתפקד כפלטפורמה להחלפה של חלק מקרומים, חומר גנטי וexosomes ויכול להיות שנחטף לכמה וירוסים להדביק תאי T; תהליך זה נקרא transinfection 11-13.
כמה חיידקים פתוגניים (חיידקי ליסטריה, סלמונלה enterica וflexneri Shigella) יכולים לפלוש לימפוציטים מסוג T in vivo ולשנות את ההתנהגות שלהם 14-16. יש לנותאר לאחרונה כי לימפוציטים מסוג T הוא גם מסוגל לתפוס חיידקים על ידי transinfection מהתאים דנדריטים נגועים בעבר (DCS) במהלך הצגת אנטיגן 16. תא T ללכוד חיידקים על ידי transinfection מאוד יעיל יותר (1,000-4,000x) מאשר זיהומים ישירים. הפתוגן T ללכוד תאים וחיידקים שאינם פתוגן המציין מ transinfection הוא תהליך מונע על ידי תאי T. באופן מפתיע, transinfected T (ציצי) תאים נהרגו במהירות את החיידקים שנתפסו ועשו זאת בצורה יעילה יותר מאשר phagocytes המקצועי 16. תוצאות אלו, שתשבורנה דוגמה לאימונולוגיה, מראות כי התאים של חסינות אדפטיבית יכולים לבצע פעולות שהיו כביכול בלעדיים של החסינות המולדת. בנוסף, הראינו כי תאי ציצי מפרישים כמויות גדולות של ציטוקינים פרו-דלקתיים ולהגן מפני זיהומים חיידקיים בvivo.
כאן אנו מציגים את הפרוטוקולים השונים המשמשים ללימוד תהליך transinfection חיידקים במודל עכבר. מודל זה מבוסס על השימוש בתאים מסוג CD4 + T מעכברים מהונדסים OTII, אשר נושאים ספציפי TCR לפפטיד 323-339 של OVA (OVAp) בהקשר של I-17 Ab כי אינטראקציה ספציפית עם עצם חיידקים נגוע מארו DCs נגזר (BMDCs) 18,19 עמוס OVAp, יוצר סינפסות חיסוני יציבה.
transinfection תא T ניתן דמיין ומעקב באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. בנוסף, cytometry הזרימה יכול לשמש לזיהוי תאים נגועים על ידי ניצול של הקרינה הנפלטת ידי חיידקים לבטא חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) 16,20. יתר על כן, transinfection תא T ניתן לכמת על ידי גישה רגישה יותר, assay הישרדות גנטמיצין המאפשר מדידה של מספר גדול של אירועים. גנטמיצין הוא אנטיביוטיקה שלא יכול לחדור תאים האיקריוטים. לכן, שימוש באנטיביוטיקה זו מאפשרת בידול של חיידקים תאיים ששרד את fr בנוסף לאנטיביוטיקהאלה תאיים אום שנהרגו 21.
Protocol
Representative Results
Discussion
תאי T או התאים T הם סוג של כדוריות דם לבנות שתפקיד מרכזי בחסינות תא בתיווך ושייך לתגובה החיסונית אדפטיבית 26. תאי T הם עקשן ללהידבק במבחנה אבל כמה דיווחים מצביעים על כך שהם יכולים להיות נגועים בvivo 14,15. הקשר האינטימי של תאי APC ו- T בסינפסה החיסונית לשמש…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants BFU2011-29450, BFU2008-04342/BMC from the Spanish Ministry of Science and Innovation and PIES201020I046 from Consejo Superior de Investigaciones Cientìficas (CSIC).
Materials
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | |
| r-GMCSF | Peprotech | 315-03 | |
| LPS | SIGMA | L2630-10mg | |
| Na Pyruvate | Thermo Scientific | SH3023901 | |
| 2-ME | Gibco | 31350-010 | |
| OVAp OTII (323–339) | GenScript | — | |
| Cell Strainer 70uM | BD | 352350 | |
| 30uM Syringe Filcons Sterile | BD | 340598 | |
| AutoMacs Classic | Miltenyi Biotec | 130-088-887 | |
| Gentamicin | Normon | 624601.6 | |
| Transwell | Costar | 3415 | |
| LB | Pronadisa | 1231 | |
| Agar | Pronadisa | 1800 | |
| Paraformaldehyde 16% | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton X-100 | |||
| CD8 biot | BD Biosciences | 553029 | |
| IgM Biot | ImmunoStep | Clone RMM-1 | |
| B220 Biot | BD Biosciences | 553086 | |
| CD19 biot | BD Biosciences | 553784 | |
| MHC-II Biot (I-A/I-E) | BD Biosciences | 553622 | |
| CD11b biot | Immunostep | 11BB-01mg | |
| CD11c biot | Immunostep | 11CB3-01mg | |
| DX5 biot | BD Biosciences | 553856 | |
| Gr-1 biot | BD Biosciences | 553125 | |
| CD16/CD32 | ImmunoStep | M16PU-05MG | |
| anti Salmonella | ABD Serotec | 8209-4006 | |
| CD11cPE | BD Biosciences | 553802 | |
| CD4-APC | Tonbo Biosciences | 20-0041-U100 | |
| Gr-1 APC | BD Biosciences | 553129 | |
| MHC-II (I-A/I-E) FITC | BD Biosciences | 553623 | |
| Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Invitrogen | A-21245 | |
| CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin) | Life technologies | C2110 | |
| BSA | SIGMA | A7030-100G | |
| Streptavidin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-048-101 | |
| BD FACSCanto II | BD Biosciences | — |
References
- Medzhitov, R. Recognition of microorganisms and activation of the immune response. Nature. 449 (7164), 819-826 (2007).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. . Molecular biology of the cell. , (1989).
- Pancer, Z., Cooper, M. D. The evolution of adaptive immunity. Annual Review of Immunology. 24, 497-518 (2006).
- Rhoades, R. A., Bell, D. R. . Medical Phisiology. , (2012).
- Cossart, P. Bacterial Invasion: The Paradigms of Enteroinvasive Pathogens. Science. 304 (5668), 242-248 (2004).
- Kaufmann, S. H., Schaible, U. E. Antigen presentation and recognition in bacterial infections. Current Opinion in Immunology. 17 (1), 79-87 (2005).
- Pizarro-Cerdá, J., Cossart, P. Bacterial Adhesion and Entry into Host Cells. Cell. 124 (4), 715-727 (2006).
- Dustin, M. L. T-cell activation through immunological synapses and kinapses. Immunological Reviews. 221, 77-89 (2008).
- Calabia-Linares, C., Robles-Valero, J., et al. Endosomal clathrin drives actin accumulation at the immunological synapse. Journal of Cell Science. 124 (5), 820-830 (2011).
- Westcott, M. M., Henry, C. J., Cook, A. S., Grant, K. W., Hiltbold, E. M. Differential susceptibility of bone marrow-derived dendritic cells and macrophages to productive infection with Listeria monocytogenes. Cellular Microbiology. 9 (6), 1397-1411 (2007).
- Geijtenbeek, T. B., Kwon, D. S., et al. DC-SIGN, a dendritic cell-specific HIV-1-binding protein that enhances trans-infection of T cells. Cell. 100 (5), 587-597 (2000).
- Izquierdo-Useros, N., Naranjo-Gòmez, M., et al. HIV and mature dendritic cells: Trojan exosomes riding the Trojan horse. PLoS Pathogens. 6 (3), e1000740 (2010).
- Mittelbrunn, M., Sanchez-Madrid, F. Intercellular communication: diverse structures for exchange of genetic information. Nature Reviews. Molecular cell biology. 13 (5), 328-335 (2012).
- McElroy, D. S., Ashley, T. J., D’Orazio, S. E. Lymphocytes serve as a reservoir for Listeria monocytogenes growth during infection of mice. Microbial Pathogenesis. 46 (4), 214-221 (2009).
- Salgado-Pabon, W., Celli, S., et al. Shigella impairs T lymphocyte dynamics in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (12), 4458-4463 (2013).
- Cruz Adalia, A., Ramirez-Santiago, G., et al. T cells kill bacteria captured by transinfection from dendritic cells and confer protection in mice. Cell Host and Microbe. 15 (5), 611-622 (2014).
- Barnden, M. J., Allison, J., Heath, W. R., Carbone, F. R. Defective TCR expression in transgenic mice constructed using cDNA-based alpha- and beta-chain genes under the control of heterologous regulatory elements. Immunology and Cell Biology. 76 (1), 34-40 (1998).
- Matheu, M. P., Sen, D., Cahalan, M. D., Parker, I. Generation of bone marrow derived murine dendritic cells for use in 2-photon imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (17), (2008).
- Inaba, K., Inaba, M., et al. Generation of large numbers of dendritic cells from mouse bone marrow cultures supplemented with granulocyte/macrophage colony-stimulating factor. Journal of Experimental Medicine. 176 (6), 1693-1702 (1992).
- Thöne, F., Schwanhäusser, B., Becker, D., Ballmaier, M., Bumann, D. FACS-isolation of Salmonella-infected cells with defined bacterial load from mouse spleen. Journal of Microbiological Methods. 71 (3), 220-224 (2007).
- Vaudaux, P., Waldvogel, F. A. Gentamicin antibacterial activity in the presence of human polymorphonuclear leukocytes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 16 (6), 743-749 (1979).
- Zhang, X., Goncalves, R., Mosser, D. M., Coligan, J. E. Chapter 14, The isolation and characterization of murine macrophages. Current protocols in immunology. , Unit 14.1 (2008).
- Bedoya, S. K., Wilson, T. D., Collins, E. L., Lau, K., Larkin, J. Isolation and th17 differentiation of naïve CD4 T lymphocytes. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50765 (2013).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). Journal of Visualized Experiments: JoVE. (41), (2010).
- Foucar, K., Chen, I. M., Crago, S. Organization and operation of a flow cytometric immunophenotyping laboratory. Seminars in diagnostic pathology. 6 (1), 13-36 (1989).
- Itano, A. A., Jenkins, M. K. Antigen presentation to naive CD4 T cells in the lymph node. Nature Immunology. 4 (8), 733-739 (2003).
