T celler Capture Bakterier av Transinfection fra dendrittiske celler

Summary

Her en protokoll er presentert for å måle bakterie fangst av CD4 ⁺ T-celler som oppstår i løpet av antigen-presentasjon via transinfection fra pre-infiserte dendrittiske celler (DC). Vi viser hvordan du utfører de nødvendige skritt: isolering av primærceller, infeksjon i DC, DC / T-celle konjugat formasjon, og måling av bakterie T-celle transfeksjon.

Abstract

Recently, we have shown, contrary to what is described, that CD4⁺ T cells, the paradigm of adaptive immune cells, capture bacteria from infected dendritic cells (DCs) by a process called transinfection. Here, we describe the analysis of the transinfection process, which occurs during the course of antigen presentation. This process was unveiled by using CD4⁺ T cells from transgenic OTII mice, which bear a T cell receptor (TCR) specific for a peptide of ovoalbumin (OVAp), which therefore can form stable immune complexes with infected dendritic cells loaded with this specific OVAp. The dynamics of green fluorescent protein (GFP)-expressing bacteria during DC-T cell transmission can be monitored by live-cell imaging and the quantification of bacterial transinfection can be performed by flow cytometry. In addition, transinfection can be quantified by a more sensitive method based in the use of gentamicin, a non-permeable aminoglycoside antibiotic killing extracellular bacteria but not intracellular ones. This classical method has been used previously in microbiology to study the efficiency of bacterial infections. We hereby explain the protocol of the complete process, from the isolation of the primary cells to the quantification of transinfection.

Introduction

Når et patogen infiserer sin vert, er det vanligvis en aktivering av den medfødte og ervervede immunresponser, er nødvendig for bakteriell klaring. Medfødt immunitet er den første forsvarslinje som hindrer de fleste infeksjoner. Medfødt immunitet skille på en presis måte elementer som er bevart blant brede grupper av mikroorganismer (patogen-forbundet molekylære mønstre, ^PAMPS) 1. Mekanismene for medfødt immunitet inkluderer fysiske barrierer som hud, kjemikalier barrierer (antimikrobielle peptider, lysozym) og medfødte leukocytter, som inkluderer de fagocytter (makrofager, nøytrofile og dendrittiske celler), mastceller, eosinofile, basofile og naturlige drepeceller ^2. Disse cellene identifisere og eliminere patogener, enten ved å angripe dem gjennom kontakt eller via fagocytose, som inkluderer patogen engulfing og drap. Dette system tillater ikke livslang forsvar, i motsetning til adaptiv immunitet, som gi immunologisk hukommelse mot pathogens. Den adaptive immunsystem er den andre linjen i forsvaret og er i stand til å gjenkjenne og reagere på spesifikke antigener på multippel mikrobiell og ikke-mikrobielle stoffer ^3. De viktigste komponentene i det adaptive immunsystemet er de lymfocytter, som inkluderer B-og T-celler. B-celler er involvert i den humorale respons, som utskiller antistoffer mot patogener eller eksogene proteiner. Imidlertid T-celler representerer cellemediert immunitet, modulering av immunrespons med cytokiner sekresjon eller drepe patogen-infiserte celler ^4.

Antigenpresenterende celler (APC) inkludert dendrittiske celler eller makrofager, bestanddeler av den medfødte immunsystemet, kan gjenkjenne fagocyttere patogener og prosesskomponenter i bakterielle antigener, som er presentert på celleoverflaten av hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) ^5-7. Etter APC har phagocytized patogener, de vanligvis migrere til drenering lymfeknuter, hvor de samhandler med Tceller. T-lymfocytter kan gjenkjenne spesifikke peptid-MHC komplekser av sine T cellereseptorer. Immun synapse (IS) oppstår i grenseflaten mellom et antigen belastet APC og en lymfocytt i antigenpresentasjon ^8,9. Noen bakterier kan overleve fagocytose og spre systematisk innen APC. I denne visningen infiserte APC tjene som bakterielle reservoarer eller "trojanske hester" som letter bakteriespredning ^10. Den intime kontakt mellom APC og lymfocytter som finner sted i løpet av IS dannelse også fungere som en plattform for utveksling av deler av membraner, genetisk materiale og exosomes og kan kapret for noen virus for å infisere T-celler; denne prosessen kalles transinfection ^11-13.

Noen av patogene bakterier (Listeria monocytogenes, Salmonella enterica, og Shigella flexneri) er i stand til å invadere T-lymfocytter in vivo og modifisere sin oppførsel ^14-16. Vi harnylig beskrevet som T-lymfocytter er også i stand til å fange opp bakterier ved transinfection fra tidligere infiserte dendrittiske celler (DCS) i løpet av antigenpresentasjon ^16. T-celle bakteriell fangst av transinfection meget mer effektiv (1,000-4,000x) enn direkte infeksjoner. T celler fangst patogen og ikke-patogene bakterier indikerer enn transinfection er en prosess drevet av T-celler. Påfallende, transinfected T (Tit) celler raskt drept de fangede bakteriene og gjorde det mer effektivt enn profesjonelle fagocytter ^16. Disse resultatene, som bryter et dogme for immunologi, viser at cellene i adaptiv immunitet kan utføre funksjoner som var tilsynelatende eksklusivt av medfødt immunitet. I tillegg viste vi at tit celler utskiller store mengder av pro-inflammatoriske cytokiner og beskytte mot bakterielle infeksjoner in vivo.

Her presenterer vi de ulike protokollene som brukes for å studere bakteriell transinfection prosessen musemodell. Denne modellen er basert på bruk av CD4 ⁺ T-celler fra transgene mus OTII, som bærer en TCR som er spesifikke for peptid 323-339 av OVA (OVAp) i forbindelse med I-Ab ¹⁷ som kommuniserer spesifikt med bakterieinfisert ben marrow- avledet DCs (BMDCs) ^18,19 lastet med OVAp, danner stabile immun synapser.

T-celle transinfection kan visualiseres og spores ved hjelp av fluorescens mikroskopi. I tillegg flowcytometri kan brukes for å påvise infiserte celler ved å utnytte fluorescensen avgitt av bakterier som uttrykker grønt fluorescerende protein (GFP) ^16,20. Videre kan T-celle transinfection kvantifiseres ved en mer sensitiv tilnærming, gentamicin overlevelse analyse som tillater måling av et stort antall hendelser. Gentamicin er et antibiotikum som ikke kan trenge inn i eukaryote celler. Derfor, ved bruk av dette antibiotikum tillater differensiering av intracellulære bakterier som overlevde antibiotikumet tilsetning frOM ekstracellulære de som ble drept ^21.

Protocol

Merk: Eksperimentelle prosedyrene ble godkjent av forskningsetiske komité for av Universidad Autónoma de Madrid og utført under oppsyn av Universidad Autónoma de Madrid Head of Animal Welfare and Health i samsvar med spanske og europeiske retningslinjer. Mus ble avlet i spesifikk patogen gratis (SPF) bolig, og de ​​ble avlivet av fagfolk og ved hjelp av karbondioksid (CO 2) innånding metoden. 1. Mouse benmargavledede DC Differensiering og infeksjons <p class="jove_conte…

Representative Results

Heri beskrev vi hvordan du utfører murine T-celle bakteriell transinfection fra infiserte benmarg avledet-DC og hvordan man kan måle bakterie transinfection via to ulike tilnærminger: flowcytometri og gentamicin overlevelse analyse Figur 1 oppsummerer prosedyren for å skaffe cellene.. DC er generert av inkubasjon av benmargceller med GM-CSF for 9 dager. Deretter blir DCs maturated med LPS å øke MHCII på sin membran for å laste dem senere med en bestemt peptid OVA…

Discussion

T-celler eller T-lymfocytter er en type av leukocytter som spiller en sentral rolle i celle-mediert immunitet, og hører til den adaptive immunrespons ^26. T-celler er upåvirkelig for å bli infisert in vitro, men noen rapporter tyder på at de kan være infisert in vivo ^14,15. Intime kontakter av APC og T-celler under immun synapse tjene som plattform for utveksling av biologisk materiale ^13, inkludert noen virus som HIV ^11. Det ble nylig vist at i motsetnin…

Materials

RPMI	Fisher Scientific	SH3025501
r-GMCSF	Peprotech	315-03
LPS	SIGMA	L2630-10mg
Na Pyruvate	Thermo Scientific	SH3023901
2-ME	Gibco	31350-010
OVAp OTII (323–339)	GenScript	—
Cell Strainer 70uM	BD	352350
30uM Syringe Filcons Sterile	BD	340598
AutoMacs Classic	Miltenyi Biotec	130-088-887
Gentamicin	Normon	624601.6
Transwell	Costar	3415
LB	Pronadisa	1231
Agar	Pronadisa	1800
Paraformaldehyde 16%	Electron Microscopy Sciences	15710
Triton X-100
CD8 biot	BD Biosciences	553029
IgM Biot	ImmunoStep	Clone RMM-1
B220 Biot	BD Biosciences	553086
CD19 biot	BD Biosciences	553784
MHC-II Biot (I-A/I-E)	BD Biosciences	553622
CD11b biot	Immunostep	11BB-01mg
CD11c biot	Immunostep	11CB3-01mg
DX5 biot	BD Biosciences	553856
Gr-1 biot	BD Biosciences	553125
CD16/CD32	ImmunoStep	M16PU-05MG
anti Salmonella	ABD Serotec	8209-4006
CD11cPE	BD Biosciences	553802
CD4-APC	Tonbo Biosciences	20-0041-U100
Gr-1 APC	BD Biosciences	553129
MHC-II (I-A/I-E) FITC	BD Biosciences	553623
Alexa-Fluor 647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed	Invitrogen	A-21245
CMAC (7-amino-4-chloromethylcoumarin)	Life technologies	C2110
BSA	SIGMA	A7030-100G
Streptavidin MicroBeads	Miltenyi Biotec	130-048-101
BD FACSCanto II	BD Biosciences	—