Espalhando superfície e Immunostaining de cromossomas da levedura
Summary
A method for surface-spreading chromosomes from budding yeast is presented. This method is derived from a method previously described by Loidl and Klein. In addition, we demonstrate a procedure for immunostaining of spread chromosomes.
Abstract
The small size of nuclei of the budding yeast Saccharomyces cerevisiae limits the utility of light microscopy for analysis of the subnuclear distribution of chromatin-bound proteins. Surface spreading of yeast nuclei results in expansion of chromatin without loss of bound proteins. A method for surface spreading balances fixation of DNA bound proteins with detergent treatment. The method demonstrated is slightly modified from that described by Josef Loidl and Franz Klein1,2. The method has been used to characterize the localization of many chromatin-bound proteins at various stages of the mitotic cell cycle, but is especially useful for the study of meiotic chromosome structures such as meiotic recombinosomes and the synaptonemal complex. We also describe a modification that does not require use of Lipsol, a proprietary detergent, which was called for in the original procedure, but no longer commercially available. An immunostaining protocol that is compatible with the chromosome spreading method is also described.
Introduction
A levedura de germinação Saccharomyces cerevisiae oferece muitas vantagens para estudos de mecanismos moleculares de processos biológicos, incluindo o estudo de proteínas que controlam a função cromossoma. Embora existam vantagens bem conhecidas de brotamento de levedura para estudos genéticos, moleculares e bioquímicos, estudos citológicos da distribuição de proteínas no núcleo da célula é complicada pelo seu tamanho pequeno. O núcleo típico de levedura tem um diâmetro de menos de um micron, que é apenas cerca de 5 vezes o limite de resolução da luz visível. Assim, a quantidade de informação sobre a distribuição de proteínas nucleares que pode ser obtido a partir de imunocoloração convencional ou usando as marcas de proteínas fluorescentes, tais como proteína fluorescente verde (GFP), é limitada. Uma abordagem útil para caracterizar a distribuição de proteínas é subnuclear superfície cromossoma espalhamento. Esta abordagem envolve a remoção da parede celular, interrompendo celular e membranas nucleares, e umllowing o conteúdo insolúveis do núcleo para assentar sobre a superfície de uma lâmina de microscópio. Estes componentes insolúveis incluem a matriz nuclear e os cromossomas. Além de permitir a remoção do conteúdo nuclear solúveis, o que aumenta a capacidade para detectar proteínas ligadas cromatina, o cromossoma espalhando método resulta em substancial descompressão dos cromossomas de modo a que os núcleos propagação têm diâmetros de cerca de 3 a 5 um (para os núcleos diplóides meióticas) e 2 a 3 mm para núcleos diplóides mitóticas. Isto permite a detecção de descompressão subestrutura nuclear que é relativamente difícil ou impossível de resolver em núcleos intactos.
Uma desvantagem óbvia no cromossoma de espalhamento é a possibilidade de que o processo de espalhamento podem parcialmente ou completamente perturbar a estrutura de interesse. Particularmente preocupante é que um cromossomo ligado proteína particular podem ser perdidos como consequência do processo de propagação. Esta complicação potencial should ser mantido em mente ao interpretar os dados. Um exemplo de uma proteína que é sensível ao procedimento de propagação é o beta-tubulina. Sob algumas condições, o fuso, o qual é composto principalmente de tubulina, é preservada durante o espalhamento 3. Visualização do fuso é frequentemente útil para encenar núcleos de interesse. No entanto, visualizando tubulina requer tratamento com um fixador de elevada concentração; fusos são perdidos sob as condições padrão descritas abaixo. Este exemplo ilustra que, quando se analisa a distribuição de uma proteína anteriormente não caracterizada, é importante variar a concentração do fixador para determinar a sensibilidade da proteína é referida variação. A despeito da preocupação com o impacto das condições de propagação em estrutura dos cromossomas, a utilidade e o método de alimentação de propagação tem sido demonstrada em muitos contextos e tem ampla utilidade na caracterização de mitose e, especialmente células meióticas 4-7.
TwO espalhamento métodos têm sido utilizados extensivamente. O primeiro destes métodos, desenvolvidos pela Dresser Giroux e 8, evita a utilização de detergente e pode produzir preparações propagação que parecem ter morfologia cromossoma relativamente bem preservada quando coradas para o corante de DAPI-ADN específica. No entanto, este método é relativamente difícil e aperfeiçoar a qualidade dos núcleos propagação varia dramaticamente, quando uma região de uma corrediça é comparada com outras regiões. Este problema pode complicar abordagens quantitativas que envolvem imagiologia muitos núcleos não selecionados de um slide para evitar viés de aquisição de dados. O segundo cromossomo método espalhando, desenvolvido pela Loidl e Klein 1, envolve o equilíbrio de fixação por paraformaldeído, com lise e descompressão cromatina promovido por uma solução de detergente. Quando executado corretamente, este método dá resultados muito reprodutíveis com menos variação de região para região, em comparação com o método Dresser and Giroux. Esta apresentação se concentra em um modified versão do método de Loidl e Klein, por causa da sua fiabilidade e a simplicidade.
Cromossoma propagação não é complicada ou demorada; até 100 lâminas pode ser preparado para a imunocoloração num único dia. Além disso, as preparações de propagação pode ser armazenado no congelador durante anos antes da imunocoloração, e, assim, laboratórios pode desenvolver um repositório de barrar cromossómicas congelados que podem ser usados quando novas perguntas biológicos surgem novos reagentes de coloração ou tornar-se disponíveis.
O método cromossoma espalhamento é mais comummente usado em combinação com imuno fluorescência e microscopia de campo amplo, mas também é possível preparar as lâminas de super-resolução métodos microscópicos de luz, tais como esgotamento de emissão estimulada microscopia (STED).
Protocol
Representative Results
Discussion
The appearance of spread nuclei critically depends upon the balance between fixation and lysis/detergent treatment. As discussed above, the preservation of varying cellular structures requires the use of different PFA concentrations. For most proteins, 3% PFA is optimal. However, preservation of spindles requires use of 4% PFA. Even with a single set of reagents, the timing of lysis relative to fixation can also affect the quality of spread nuclei. For the most consistent results, the time of lysis should be normalize…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by NIH grant GM50936 to DKB.
Materials
| Zymolyase | US Biological | Z1004 | Prepare 20 mg/mL solution in 50 mM Tris pH 7.5 supplemented with 2% glucose. Prepare fresh each experiment and store at 4°C until ready for use. |
| Lipsol | L.I.P. Ltd | no longer commercially available | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| NP-40 | USB | 19628 | Prepare 1% (v/v) solution in water. Store on ice. |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| Slides | Corning | 2948-75×25 | |
| Standard coverslip | Fisher | 12-544-E or 12-540-B | |
| High resolution coverslips | Fisher | 12-542-B | |
| Photo-Flo 200 solution | Kodak | P-7417 | Prepare 0.2% (v/v) solution in water. |
| TBS | 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 24.7 mM Tris, pH 8 | ||
| BSA | Sigma | A2153 | Prepare a 1% (w/v) solution in TBS. Store at 4°C for up to a month. |
| Primary antibody | |||
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit | Invitrogen | A-21206 | |
| IgG (H+L) Antibody | |||
| Vectashield mounting media with DAPI | Vector Laboratories |
H-1200 | |
| ProLong Gold | Invitrogen | P36930 | |
| Plastic slide box | Fisher | 03-448-1 | Store slides containing dried spreads in slots at -20°C. Also, use as a wet chamber. |
| Cardboard slide box | Fisher | 12-587-10 | Use to conveniently transport stained/sealed slides or store at 4°C. |
| Coplin jar | Fisher | 08-816 | Use as a wash basin for slides. |
References
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- Loidl, J., Klein, F., Engebrecht, J. Genetic and morphological approaches for the analysis of meiotic chromosomes in yeast. Methods in cell biology. 53, 257-285 (1998).
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