Användning av Ramsay analys för att mäta vätskeutsöndringen och Ion Flux priser i<em> Drosophila melanogaster</em> Malpighian tubuli

Summary

Detta protokoll beskriver användningen av Ramsay-analysen för att mäta fluidsekre priser från isolerade Malpighian (renal) tubuli från Drosophila melanogaster. Dessutom till användning av jonspecifika elektroder mäta natrium- och kaliumkoncentrationer i den utsöndrade fluiden, vilket möjliggör beräkning av transepitelial jonflödet, beskrivs.

Abstract

Modulering av njur epitel jontransport tillåter organismer att upprätthålla joniska och osmotiska homeostas i ansiktet av varierande yttre förhållanden. Drosophila melanogaster Malpighian (renal) tubuli erbjuder en unik möjlighet att studera de molekylära mekanismerna för epitel jontransport, på grund av de kraftiga genetik denna organism och tillgängligheten av dess njurtubuli till fysiologisk studie. Här beskriver vi användningen av Ramsay-analysen för att mäta fluidsekre priser från isolerade gylf renala tubuli, med användning av jonspecifika elektroder för att mäta natrium- och kaliumkoncentrationer i den utsöndrade fluiden. Denna analys medger studie av transepitelial vätske- och jonflöden av ~ 20 tubuli i taget, utan att det är nödvändigt att överföra den utsöndrade fluiden till en separat anordning för att mäta jonkoncentrationer. Genetiskt distinkta tubuli kan analyseras för att bedöma betydelsen av specifika gener i transportprocesser. Dessutom bathing saltlösning kan modifieras för att undersöka effekterna av dess kemiska egenskaper, eller läkemedel eller hormoner tillsatta. Sammanfattningsvis kan denna teknik molekylär karakterisering av de grundläggande mekanismerna för epitel jontransport i Drosophila tubuli, samt reglering av dessa transportmekanismer.

Introduction

Renal epitel jontransport ligger bakom organism iono- och osmoregulation. Drosophila melanogaster Malpighian (renal) tubuli erbjuder en unik möjlighet att studera de molekylära mekanismerna för epitel jontransport. Detta beror på kombinationen av de kraftfulla genetik av Drosophila, ihopkopplade med tillgängligheten till sina njurtubuli till fysiologisk studie. The Ramsay-analysen, uppkallad efter den utredare som banat väg för tekniken ^1, mäter vätska sekre priser från isolerade Malpighian tubuli, som grundades i Drosophila 1994 av Dow och kollegor ^2. Detta banade väg för fortsatta studier med hjälp av Drosophila genetiska verktyg, såsom GAL4-UAS systemet ^3,4, för att definiera cellspecifika signalvägar som reglerar vätskeutsöndring. Ett exempel innefattar kalciumsignalering som svar på ett peptidhormon ^5, bland många andra ^6,7.

ve_content "> En kombination av genteknik och klassisk fysiologisk studie har visat att urinproduktionen i farten sker genom utsöndring av en kaliumklorid rika vätska från huvud segment av tubuli. Detta sker genom parallell transepiteliala utsöndringen av katjoner, främst K ⁺ men också Na ^+, genom huvud cellen, och Cl ^-. sekre genom stelcellen ^8-12 Möjligheten att separat mäta transepiteliala K ⁺ och Na ⁺ flöden tillåter en mer detaljerad beskrivning av transportmekanismer än mätning av vätskeutsöndring ensam. Till exempel i ostimulerade Drosophila tubuli, Na ⁺ / K ⁺ -ATPas-hämmare ouabain har ingen effekt på vätskeutsöndring ^2, även om dess upptagning i huvud celler hämmas av den organiska anjontransportpolypeptiden hämmare taurokolat ^13. dock Linton och O'Donnell visade att ouabain depolariserarden basolaterala membranpotentialen och ökar Na ⁺ flux ^9. Som framgår av Representativa resultat, replikerade vi dessa resultat och visade att K ⁺ flödet är samtidigt ^minskade med 14; den ökade Na ⁺ flöde och minskad K ⁺ flux har motsatta effekter på vätskeutsöndring, vilket resulterar i någon nettoförändring av sekretion. Det finns alltså två resolutioner till "ouabain paradoxen", det vill säga den första observationen att ouabain har någon effekt på vätskeutsöndring i Drosophila tubuli. Först i stimulerade tubuli, är inte uppenbart att effekten av ouabain på vätskeutsöndring på grund av dess upptag av organic anion transporter ^13; och andra, i ostimulerade tubuli, ouabain har motsatta effekter på transepitelial Na ⁺ och K ⁺ flöde, vilket resulterar i någon nettoförändring i vätskeutsöndring (se Representativa resultat och ref. 9). Därför primära roll Na ⁺ / K ⁺ -ATPas i ostimulerade tubuli är att sänka intracellulär Na ⁺ koncentration för att generera en positiv koncentrationsgradient för Na ⁺ -kopplade transportprocesser över basolaterala membranet. I själva verket, genom att separat mäta Na ⁺ och K ⁺ flussmedel, vi visade att tubuli saknar fly natrium-kalium-2-klorid cotransporter (NKCC) har minskat transepitelial K ⁺ flux, utan ytterligare minskning efter ouabain Dessutom, och ingen förändring i transepitelial ^Na * flux ^14. Dessa upptäckter stödde vår slutsats att ^Na ^ in i cellen genom NKCC recirkuleras via ^Na * / ^K + -ATPas. I ett annat exempel, Ianowski et al. Konstaterade att sänka bad K ⁺ koncentration från 10 mM till 6 mM minskade transepiteliala K ⁺ flöde och ökad transepiteliala Na ⁺ flödet i tubuli från Rhodnius prolixus, utan nettoförändring i vätskeutsöndring <sup> 15. Särskiljande effekter på Na ⁺ flöde och K ⁺ flux över larv tubuli har också observerats i Drosophila tubuli som svar på varierande saltdieter ¹⁶ och två myggarter som svar på uppfödning salthalt ^17.

Den största utmaningen i mätningen av transepiteliala jonflöde i Ramsay analys preparatet är bestämningen av jonkoncentrationer inom utsöndrade vätskan. Denna utmaning har mötts med varierande lösningar, inklusive låga photometery ^18, användning av radioaktiva joner ¹⁹ och elektronsond våglängd spektroskopi ^20. Dessa tekniker kräver överföring av den utsöndrade vätskan sjunka till ett instrument för mätning av jonkoncentrationer. Eftersom volymen hos fluid utsöndras av ostimulerade Drosophila tubulus är liten, typiskt ~ 0,5 Nl / min, utgör detta en teknisk utmaning och dessutom införs fel om en del av den utsöndrade fluiden ärförloras vid överföring. Däremot möjliggör användning av jonspecifika elektroder mätningen av jonaktivitet (från vilken jonkoncentration kan beräknas) in situ. Den nuvarande protokollet anpassades från det som används av Maddrells och kollegor att mäta transepiteliala K ⁺ flöde över Rhodnius tubuli använder valinomycin som K ⁺ jonoforen ^21, och även beskriver användningen av en 4-tert butylkalix [4] aren-tetraättiksyra tetraetylester baserade Na ⁺ specifik jon-specifik elektrod kännetecknas av Messerli et. al. ^22. Jonspecifika elektroder har också använts för att mäta jonkoncentrationer i vätska som utsöndras från Malpighian tubuli i Ramsay analys i vuxen ^9,23 och larver ¹⁶ Drosophila melanogaster, den nyzeeländska alpina Weta (Hemideina maori) ²⁴ och i myggor ^17.

Här beskriver vi i detalj användningen av Ramsay somsäga att mäta fluidsekrehastigheter i Malpighian tubuli från Drosophila melanogaster, liksom användning av jonspecifika elektroder för att bestämma koncentrationerna av ^K + och Na ⁺ inom den utsöndrade fluiden och därmed beräkningen av transepiteliala jonflöden. En översikt av analysen tillhandahålls i figur 1.

Figur 1. Skiss över Malpighian Sugrör och Ramsay analys med användning av Ion-specifika elektroder för att mäta jonkoncentrationer. Denna figur illustrerar inställningarna för den Ramsay analysen. (A) Varje fluga har fyra tubuli, ett par främre tubuli och ett par bakre kanalerna, som flyter i bukhålan omgiven av hemolymph. I varje par, de två små rören gå i urinledaren, som sedan tömmer urin vid korsningen av midgut och hindgut. Tubuli är blinda tills vidare. Urin genereras av fluid-utsöndrande huvudsegmentet (visat i rött), och strömmar mot urinledaren och ut i tarmen. Efter dissektion är tubuli paret skiljas från tarmen genom transecting urinledaren. (B) Paret av tubuli överförs sedan till en droppe av bad saltlösning inom en brunn av analys skålen. En av de två tubuli, hänvisas till här som den "ankare tubuli," lindas runt en metallstång och är inerta. Den andra tubuli är utsöndrar tubuli. Den initiala segmentet (som inte utsöndrar vätska) och huvudsegmentet av de utsöndrande tubulus förblir inom droppen av bad saltlösning. Joner och vatten skott från bad saltlösning och in i tubuli lumen i huvudsegmentet, och sedan röra sig mot urinledaren, som skulle ske in vivo. Det undre segmentet (blå) är utanför bad saltlösning och därmed inerta. Eftersom urinledaren kapas, framträder det utsöndrade fluiden som en droppe från den skurna änden av urinledaren. THan utsöndrade vätska droppe förstoras över tiden som sekre fortsätter och dess diameter mäts med hjälp av en okulär mikrometer. Ett lager av mineralolja förhindrar avdunstning av den utsöndrade vätskan. Referens- och jon specifika elektroder mäter jonkoncentrationen av den utsöndrade vätskan. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Protocol

1. Förbereda dissekering, kalibrering och analys Rätter Obs: I detta steg är tre petriskålar av plast fodrade med silikonelastomer ställdes: en för dissektion, en för genomförande av Ramsay analysen ("-analys skålen"), och en för att utföra kalibrering. Rätterna återanvänds från experiment till experiment, och därmed det här steget behöver bara upprepas om en maträtt raster. En bild av analysskål visas i figur 2. <p clas…

Representative Results

Figurerna 7 och 8 visar att användningen av Ramsay analysen med jonspecifika elektroder för att mäta K + och Na + koncentrationer kan skilja genetiskt och farmakologiskt distinkta K + och Na + flussmedel, information som inte fångas upp genom att mäta vätskesekreintensitet i sig. Figur 7 visar som minskade vätskeutsöndringen i tubuli från flugor bär en homozygot nollmutation i NKCC drivs av en minskning i K + flöde i muta…

Discussion

Användningen av Ramsay analysen tillsammans med jonspecifika elektroder möjliggör mätning av vätskeutsöndring priser och jonflöden i isolerade insekts Malpighian (renal) tubuli. Tjugo eller flera tubuli kan analyseras på en gång, vilket gör att högre genomströmning jämfört med analysen av individuella in vitro microperfused tubuli. Dessutom jonspecifika elektroder kan användas för bestämning av jonkoncentrationer inom den utsöndrade fluiden in situ begränsa fel som kan införas i öv…

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.