L'utilizzo del Ramsay Assay misurare la secrezione di fluidi e Ion Flux Prezzi in<em> Drosophila melanogaster</em> Tubulo Malpighi

Summary

Questo protocollo descrive l'uso del test Ramsay di misurare i tassi di secrezione di fluido dal isolate Malpighian (renale) tubuli da Drosophila melanogaster. Inoltre, l'uso di elettrodi ione-specifico per misurare le concentrazioni di sodio e potassio nel fluido secreto, consentendo il calcolo del flusso transepiteliale di ioni, è descritto.

Abstract

Modulazione di trasporto renale di ioni epiteliale permette organismi di mantenere l'omeostasi ionica e osmotico di fronte alle diverse condizioni esterne. La Drosophila melanogaster Malpighi (renale) tubulo offre un'opportunità senza precedenti per studiare i meccanismi molecolari del trasporto di ioni epiteliale, a causa delle potenti genetica di questo organismo e l'accessibilità dei suoi tubuli renali allo studio fisiologico. Qui, descriviamo l'uso del test Ramsay di misurare i tassi di secrezione di fluido dal isolato mosca tubuli renali, con l'uso di elettrodi ione-specifico per misurare le concentrazioni di sodio e potassio nel fluido secreto. Questo test consente di studio fluidi transepiteliale di ioni e flussi di ~ 20 tubuli alla volta, senza la necessità di trasferire il fluido secreto di apparecchiatura separata per misurare concentrazioni di ioni. Geneticamente tubuli distinti possono essere analizzati per valutare il ruolo di specifici geni nei processi di trasporto. Inoltre, il bsalina athing può essere modificato per esaminare gli effetti delle sue caratteristiche chimiche, o farmaci o ormoni aggiunti. In sintesi, questa tecnica permette la caratterizzazione molecolare dei meccanismi di base di trasporto ionico epiteliale nel tubulo Drosophila, nonché regolazione di questi meccanismi di trasporto.

Introduction

Renale trasporto di ioni epiteliale sottende organismal iono- e osmoregolazione. La Drosophila melanogaster Malpighi (renale) tubulo offre un'opportunità senza precedenti per studiare i meccanismi molecolari del trasporto di ioni epiteliale. Ciò è dovuto alla combinazione delle potenti genetica di Drosophila, accoppiati con l'accessibilità dei suoi tubuli renali allo studio fisiologico. Il saggio Ramsay, dal nome del ricercatore che ha aperto la strada alla tecnica ^1, misura i tassi di secrezione di fluidi da isolate tubuli malpighiani, ed è stato fondato nel Drosophila nel 1994 da Dow e colleghi ^2. Questo ha spianato la strada a ulteriori studi utilizzando Drosophila strumenti genetici, come il sistema GAL4-UAS ^3,4, per definire vie di segnalazione specifici delle cellule che regolano la secrezione di fluidi. Un esempio include segnalazione di calcio in risposta ad un ormone peptidico ^5, tra molti altri ^6,7.

ve_content "> una combinazione di tecniche genetiche e studio fisiologico classica ha dimostrato che la produzione di urina nella mosca avviene attraverso la secrezione di un potassio ricco cloruro fluido dal segmento principale del tubulo. Ciò avviene attraverso la secrezione transepiteliale parallelo di cationi, soprattutto K ⁺ ma anche Na ^+, attraverso la cella principale e Cl ^-. secrezione attraverso la cella stellate ^8-12 La capacità di misurare separatamente transepiteliali K ⁺ e Na ⁺ flussi consente una caratterizzazione più dettagliata dei meccanismi di trasporto rispetto alla misurazione della secrezione di fluido alone. Ad esempio, in unstimulated tubuli Drosophila, Na ⁺ / K ⁺ -ATPasi inibitore ouabain non ha alcun effetto sulla secrezione di fluido ^2, anche quando il suo assorbimento nelle cellule principali è inibito dal trasportatore anionico organico inibitore taurocolato ^13. Tuttavia, Linton e O'Donnell ha mostrato che ouabain depolarizzail potenziale di membrana basolaterale, e aumenta Na ⁺ flusso ^9. Come mostrato nelle Rappresentante dei risultati, abbiamo replicato questi risultati, e ha mostrato che K ⁺ flusso è contemporaneamente diminuito ^14; l'aumento del flusso di ^Na + e diminuita K ⁺ flusso avere effetti opposti sulla secrezione di liquidi, con conseguente nessun cambiamento netto della secrezione. Così, ci sono due soluzioni a "paradosso ouabaina", cioè, l'osservazione iniziale che uabaina non ha alcun effetto sulla secrezione di fluido nel tubulo Drosophila:. Primo, in tubuli stimolato, l'effetto di ouabain sulla secrezione di fluido non è evidente a causa il suo assorbimento da parte del trasportatore anionico organico ^13; e in secondo luogo, nei tubuli unstimulated, ouabain ha opposti effetti sulla transepiteliale ^Na + e K ⁺ flusso, con conseguente nessun variazione netta secrezione di fluidi (vedi Rappresentante dei risultati e rif. 9). Pertanto, il ruolo primario della Na ⁺ / K ⁺ -ATPase in tubuli non stimolati è quello di ridurre la concentrazione intracellulare di Na ⁺ per generare un gradiente di concentrazione favorevole per Na ⁺ -coupled processi di trasporto attraverso la membrana basolaterale. Infatti, misurando separatamente ^Na + e ^K + flussi, abbiamo dimostrato che tubuli manca la cotrasportatore fly sodio-potassio-2-cloruro (NKCC) sono diminuiti K transepiteliale ⁺ flusso, senza ulteriore calo dopo ouabaina aggiunta, e nessun cambiamento in transepiteliale Na ⁺ Flusso ^14. Questi risultati supportati nostra conclusione che Na ⁺ di entrare nella cellula attraverso la NKCC viene riciclato attraverso il Na ⁺ / K ⁺ ATPasi. In un altro esempio, Ianowski et al. Ha osservato che l'abbassamento bagno K ⁺ concentrazione da 10 a 6 mm è diminuito transepiteliale K ⁺ flusso e aumento transepiteliale Na ⁺ flusso nel tubuli da Rhodnius prolixus, senza variazione netta secrezione di fluidi <sup> 15. Diversi effetti sulla Na ⁺ K ⁺ flusso e flusso attraverso tubuli larvali sono stati osservati anche nei tubuli Drosophila in risposta alle diverse diete sale ¹⁶ e in due specie di zanzare in risposta ad allevamento salinità ^17.

La sfida più grande nella misurazione del flusso transepiteliale di ioni nella preparazione dosaggio Ramsay è la determinazione delle concentrazioni di ioni all'interno del fluido secreto. Questa sfida è stata accolta con soluzioni diverse, tra cui la fiamma photometery ^18, l'uso di ioni radioattivi ^19, ed elettrone sonda lunghezza d'onda spettroscopia dispersiva ^20. Queste tecniche richiedono trasferimento della goccia liquido secreto a uno strumento di misura della concentrazione di ioni. Poiché il volume di fluido secreto dalla non stimolato Drosophila tubulo è piccolo, tipicamente ~ 0,5 Nl / min, questo pone una sfida tecnica e introduce anche errore se parte del fluido è secretoperso al momento del trasferimento. Al contrario, l'uso di elettrodi ione-specifico permette la misura dell'attività ionica (da cui la concentrazione di ioni può essere calcolato) in situ. Il protocollo attuale è stato adattato da quella utilizzata da Maddrell e colleghi per misurare transepiteliale K ⁺ flusso attraverso il tubulo Rhodnius utilizzando valinomicina come il K ⁺ ionoforo ^21, e descrive anche l'uso di un -butylcalix 4- ter [4] acido arene-tetraacetico tetraetile estere basato ^Na + -specifica elettrodi specifici ioni di litio caratterizzata da Messerli et. al. ^22. Elettrodi Ion-specifici sono stati utilizzati anche per misurare le concentrazioni di ioni nel fluido secreto dalle tubuli malpighiani nel test Ramsay negli adulti ^9,23 e larvale ¹⁶ Drosophila melanogaster, la Nuova Zelanda Alpine Weta (Hemideina maori) ²⁴ e ¹⁷ zanzare.

Qui, descriviamo in dettaglio l'uso del Ramsaydire di misurare i tassi di fluido secrezione nei tubuli malpighiani da Drosophila melanogaster, nonché l'uso di elettrodi ione-specifico per determinare le concentrazioni di K ⁺ e Na ⁺ nel liquido secreto e quindi il calcolo dei flussi transepiteliale di ioni. Una panoramica del test è fornito in Figura 1.

Figura 1. Schema del Malpighi tubuli e la Ramsay test con l'uso di ioni a specifici elettrodi per misurare concentrazioni di ioni. Questa figura illustra la configurazione per il saggio Ramsay. (A) Ogni mosca ha quattro tubuli, un paio di tubuli anteriori e una coppia di tubuli posteriori, che galleggiano nella cavità addominale circondato da emolinfa. In ogni coppia, i due si uniscono a tubuli l'uretere, che poi svuota l'urina all'incrocio tra midgut e hindgut. I tubuli sono ciechi a tempo indeterminato. L'urina viene generato attraverso il segmento principale del fluido-secernente (mostrato in rosso), e scorre verso l'uretere e fuori nell'intestino. Dopo la dissezione, la coppia tubulo è dissociata dall'intestino da sezionare l'uretere. (B) La coppia di tubuli viene poi trasferita in una goccia di soluzione salina in un bagno ben del piatto dosaggio. Uno dei due tubuli, qui definito il "ancoraggio tubulo," è avvolto attorno ad un perno di metallo ed è inerte. L'altro è il tubulo tubulo secernente. Il segmento iniziale (che non secernono liquido) e il segmento principale del tubulo secernono rimangono entro la goccia di soluzione salina balneazione. Ioni e spostare l'acqua dalla salina di balneazione e nel lume del tubulo del segmento principale, e poi si muovono verso l'uretere, come accadrebbe in vivo. Il segmento inferiore (blu) è fuori dalla salina di balneazione e quindi inerte. Poiché l'uretere è tagliato, il liquido secreto emerge come una gocciolina dall'estremità tagliata dell'uretere. Tegli secreto fluido gocciolina allarga nel tempo la secrezione continua, e il suo diametro viene misurato con un micrometro oculare. Uno strato di olio minerale impedisce l'evaporazione del fluido secreto. Gli elettrodi di riferimento specifici e ioni misurano la concentrazione di ioni di liquido secreto. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Preparazione la dissezione, taratura e Assay Piatti Nota: In questo passaggio, tre scatole Petri in plastica rivestiti con elastomero siliconico vengono preparati: uno per la dissezione, uno per l'esecuzione del saggio Ramsay ("piatto assay"), ed uno per eseguire la calibrazione. Questi piatti sono riutilizzati da esperimento a esperimento, e, quindi, ciò deve essere ripetuta se si rompe un piatto. Un'immagine del piatto test è mostrato nella Figur…

Representative Results

Le figure 7 e 8 dimostrano che l'uso del saggio Ramsay con elettrodi specifici ioni per misurare concentrazioni K + e Na + possono distinguere geneticamente e farmacologicamente distinto K + e flussi Na +, informazioni che non sono catturati misurando i tassi di secrezione di fluido da solo. Figura 7 mostra che diminuiscono la secrezione di fluidi nei tubuli da mosche trasportano un null mutazione omozigotica nel NKCC è guidato da una dim…

Discussion

L'uso del saggio Ramsay, insieme con elettrodi ione-specifico, permette la misura dei tassi di secrezione di fluido e flussi ionici in isolato insetti malpighiani (renali) tubuli. Venti o più tubuli possono essere dosati in un momento, consentendo un throughput più elevato rispetto al dosaggio dei singoli tubuli in vitro microperfused. Inoltre, gli elettrodi ione-specifico consentono la determinazione delle concentrazioni di ioni all'interno del fluido secreto in situ, limitando errori che po…

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.