Gebruik van de Ramsay Assay Fluid Afscheiding en Ion Flux tarieven in de Meet<em> Drosophila melanogaster</em> Malpighian buisje

Summary

Dit protocol beschrijft het gebruik van de Ramsay assay vloeistofsecretie tarieven van geïsoleerde Malpighian (renale) tubuli van Drosophila melanogaster gemeten. Bovendien, het gebruik van een ionen-specifieke elektrode natrium en kalium concentraties te meten in de afgescheiden vloeistof, zodat berekening van transepitheliale ionenflux, wordt beschreven.

Abstract

Modulatie van renale epitheliale ionentransport maakt organismen en osmotische ionische homeostase in aanwezigheid van verschillende externe omstandigheden. De Drosophila melanogaster Malpighian (renale) tubulus biedt een unieke gelegenheid om de moleculaire mechanismen van epitheel ionentransport bestuderen, vanwege de krachtige genetica van dit organisme en de toegankelijkheid van de renale tubuli fysiologische onderzoek. Hier beschrijven we het gebruik van Ramsay assay vloeistofsecretie tarieven van geïsoleerde fly niertubuli meten met gebruik van een ionen-specifieke elektrode natrium en kalium concentraties te meten in de afgescheiden vloeistof. Deze test maakt onderzoek transepitheliaal vocht en ionen stromen van ~ 20 tubules tegelijk, zonder dat de afgescheiden vloeistof te dragen aan een afzonderlijke inrichting te ion concentraties te meten. Genetisch verschillende buisjes kunnen worden geanalyseerd om de functie van specifieke genen beoordelen transportprocessen. Bovendien, de bathing zout kan worden aangepast om de effecten van de chemische eigenschappen of geneesmiddelen of hormonen toegevoegd onderzoeken. Samengevat, deze techniek kan de moleculaire karakterisatie van de basismechanismen van epitheel ionentransport in Drosophila tubulus, evenals regulering van deze transportmechanismen.

Introduction

Nierepitheel ionentransport grondslag organismal iono- en osmoregulatie. De Drosophila melanogaster Malpighian (nier) buisje biedt een unieke kans om de moleculaire mechanismen van epitheliale ionentransport bestuderen. Dit komt door de combinatie van de krachtige genetica van Drosophila, gekoppeld aan de toegankelijkheid van de renale tubuli fysiologische onderzoek. De Ramsay test, genoemd naar de onderzoeker die de techniek ¹ pionier, meet vloeistof secretie tarieven van geïsoleerde Malpighian buisjes, en werd opgericht in Drosophila in 1994 door Dow en collega's ^2. Dit maakte de weg vrij voor verdere studies met behulp van Drosophila genetische instrumenten, zoals het GAL4 UAS-systeem ^3,4 tot cel-specifieke signaalwegen reguleren vloeistof secretie te definiëren. Een voorbeeld omvat calciumsignalen in reactie op een peptide hormoon ^5, onder vele anderen ^6,7.

ve_content "> Een combinatie van genetische technieken en klassieke fysiologische studie heeft aangetoond dat urine generatie treedt de vlieg door de afscheiding van een kaliumchloride-rijke vloeistof uit het hoofdsegment van de tubulus. Dit gebeurt door de parallelle transepitheliale afscheiding van kationen, vooral K ⁺ maar ook ^Na +, door middel van de belangrijkste cel en Cl ^-. secretie door de stellaatcel ^12/08 De mogelijkheid om transepitheliaal K ⁺ en Na ⁺ fluxen afzonderlijk te meten maakt een meer gedetailleerde karakterisering van de mechanismen vervoer dan het meten van de vloeistof secretie alone. Bijvoorbeeld in ongestimuleerde Drosophila buisjes, de Na ⁺ / K ⁺ -ATPase-remmer ouabaïne heeft geen invloed op vloeistofsecretie ^2, zelfs wanneer de opname in belangrijkste cellen wordt geremd door organische anion transporter inhibitor taurocholaat ^13. Echter, Linton en O'Donnell toonde aan dat ouabain depolariseertde basolaterale membraanpotentiaal en verhoogt Na ⁺ flux ^9. Zoals getoond in de representatieve resultaten gerepliceerde we deze bevindingen, en toonden aan dat K ⁺ flux gelijktijdig afgenomen ^14; de verhoogde ^Na + flux en verminderde K ⁺ flux hebben tegengestelde effecten op de vloeistof secretie, wat resulteert in geen netto verandering in de afscheiding. Er zijn dus twee oplossingen voor dit "ouabain paradox", dwz de aanvankelijke waarneming dat ouabaïne geen effect heeft op vloeistofsecretie in Drosophila tubulus. Eerst, in gestimuleerde buisjes het effect van ouabaïne op vloeistofsecretie blijkt niet te wijten aan de opname door het organische anion transporter ^13; en ten tweede, in gestimuleerde buisjes, ouabain heeft tegengestelde effecten op transepitheliaal ^Na + en K ⁺ stroom, waardoor er geen netto verandering in de vloeistof secretie (zie Representatieve resultaten en ref. 9). Daarom is de primaire rol van de Na ⁺ / K ⁺ -ATPase in gestimuleerde buisjes is om intracellulaire ^Na + concentratie te verlagen tot een gunstige concentratiegradiënt genereren voor Na ⁺ -gekoppelde transport processen in de basolaterale membraan. Immers, door het afzonderlijk meten van ^Na + en K ⁺ fluxen we aangetoond dat tubules zonder de fly natrium-kalium-2-chloride cotransporter (NKCC) gedaald transepitheliaal K ⁺ flux, zonder verdere afname na ouabain toevoeging en geen verandering in epitheel ^Na + flux ^14. Deze bevindingen ondersteunden conclusie dat Na ⁺ het invoeren van de cel door de NKCC wordt gerecycled via de Na ⁺ / K ⁺ -ATPase. In een ander voorbeeld Ianowski et al. Vastgesteld dat het verlagen bath K ⁺ concentratie van 10 mM tot 6 mM verminderde transepitheliaal K ⁺ flux en verhoogde transepitheliaal Na ⁺ flux in buisjes van Rhodnius prolixus, zonder netto verandering in vloeistofsecretie <sup> 15. Differentiële effecten van ^Na + en K ⁺ flux flux over larvale buisjes Ook in Drosophila buisjes waargenomen als reactie op variërende zout diëten ¹⁶ en twee soorten muggen in reactie op fokken zoutgehalte ^17.

De grootste uitdaging bij het meten van transepitheliale ion flux in de Ramsay assay preparaat is het bepalen van ion concentraties in de afgescheiden vloeistof. Deze uitdaging is voldaan met verschillende oplossingen, waaronder vlam photometery ^18, het gebruik van radioactieve ionen ¹⁹ en elektronen probe golflengte dispersieve spectroscopie ^20. Deze technieken vereisen de overdracht van de afgescheiden vloeistof druppel een instrument voor het meten van ionenconcentraties. Omdat de hoeveelheid vloeistof afgescheiden door de gestimuleerde Drosophila tubulus is klein, kenmerkend ~ 0,5 nl / min, dit vormt een technische uitdaging en introduceert ook fout als een deel van de afgescheiden vloeistofverloren bij de overdracht. In tegenstelling, het gebruik van een ionen-specifieke elektrode maakt de meting van de ionen-activiteit (waarvan ionen berekend kan worden) in situ. Het huidige protocol werd aangepast van die welke door Maddrell en collega's transepitheliaal K ⁺ flux over de Rhodnius tubulus meten met behulp valinomycine als K ⁺ ionofoor ^21, en ​​beschrijft ook de toepassing van een 4-tert -butylcalix [4] areen-azijnzuur tetraethyl-ester gebaseerde ^Na * -specifieke ionen-specifieke elektrode kenmerk Messerli et. al. ^22. Ion-specifieke elektroden zijn ook gebruikt om ionenconcentraties in vloeistof afgescheiden door Malpighian tubuli in de Ramsay assay bij volwassen en larven ^{9,23 16} Drosophila melanogaster gemeten, de Nieuw-Zeelandse Alpine Weta (Hemideina maori) ²⁴ en ¹⁷ muggen.

Hier beschrijven we in detail de toepassing van de Ramsay alszeg vloeistofsecretie prijzen Malpighi buisjes uit Drosophila melanogaster, evenals het gebruik van een ionen-specifieke elektrode om de concentratie van K ⁺ en Na ⁺ in de afgescheiden vloeistof te bepalen en dus de berekening van transepitheliale ionfluxen meten. Een overzicht van de assay wordt gegeven in figuur 1.

Figuur 1. Schematische voorstelling van de Malpighian Buisjes en Ramsay Assay met gebruik van Ion-specifieke elektroden te meten Ion Concentraties. Dit cijfer illustreert de setup voor de Ramsay test. (A) Elk fly vier tubules, een paar voorste tubuli en een paar achterste tubuli, die zweven in de buikholte omgeven door hemolymfe. In elk paar zijn de twee buisjes mee in de urineleider, die vervolgens leegt de urine op de kruising van de middendarm en hindgut. De buisjes zijn blind-geëindigd. Urine wordt gegenereerd door de fluïdum uitscheidende hoofdsegment (getoond in rood), en stroomt naar de ureter en buiten in de darm. Na dissectie, is het buisje paar losgekoppeld van de darm door transecting de urineleider. (B) Het paar buisjes wordt vervolgens overgebracht in een druppel baden saline binnen een putje van de assay schotel. Een van de twee tubuli, hier aangeduid als de "anchor tubulus," is rond een metalen pen en inert. Het andere buisje is het afscheidende buisje. De eerste segment (die niet uitscheiden vloeistof) en hoofdsegment van het afscheidende tubulus blijven binnen de druppel baden zoutoplossing. Ionen en water beweging van de baden zoutoplossing en in de tubulus lumen van de belangrijkste segment, en ga dan verder in de richting van de urineleider, zoals zou optreden in vivo. Het lagere segment (blauw) is buiten het bad zoute en dus inert. Aangezien de ureter wordt gesneden, de afgescheiden vloeistof naar voren als een druppel van het afgesneden uiteinde van de ureter. Thij afgescheiden vloeistof druppel vergroot in de tijd als afscheiding blijft, en de diameter wordt gemeten met behulp van een oculaire micrometer. Een laag minerale olie voorkomt verdamping van de vloeistof afgescheiden. De referentie en ion specifieke elektroden meten van de ion concentratie van de afgescheiden vloeistof. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Protocol

1. Voorbereiding van de Dissection, kalibratie en Assay Gerechten Opmerking: In deze stap worden drie plastic petrischalen bekleed met silicone-elastomeer bereid: één voor dissectie, een voor het uitvoeren van de assay Ramsay ("assay dish"), en één voor het uitvoeren van de kalibratie. Deze schotels worden hergebruikt van experiment tot experiment en dus deze stap alleen nodig herhaald wanneer een schotel breekt. Een foto van de assay schaal is weergegeven …

Representative Results

Figuren 7 en 8 tonen aan dat het gebruik van de Ramsay test met ionen-specifieke elektrode naar K + en Na + concentraties te meten kan genetisch en farmacologisch verschillende K + en Na + fluxen, informatie die niet wordt opgevangen door meetvloeistof secretiesnelheden alleen onderscheiden. Fig 7 toont dat vloeistofsecretie afgenomen buisjes tegen vliegen die een homozygote nul-mutatie in het NKCC wordt aangedreven door een afname van K …

Discussion

Het gebruik van Ramsay assay, samen met ion-specifieke elektroden, maakt de meting van vloeistofsecretie prijzen en ionfluxen in geïsoleerde insecten Malpighi (renale) tubuli. Twintig of meer buisjes kunnen worden getest tegelijk, waardoor hogere doorvoercapaciteit in vergelijking met de test van afzonderlijke in vitro microperfused tubuli. Bovendien ionen-specifieke elektrode maken de bepaling van de ionenconcentraties in de afgescheiden vloeistof in situ, dat fouten bij de overdracht van kl…

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.