Bruk av Ramsay analysen å måle fluidsekresjon og Ion Flux priser i<em> Drosophila melanogaster</em> Malpighian tubule

Summary

Denne protokollen beskriver bruken av den Ramsay assay for å måle fluid sekresjon av priser fra isolerte Malpighian (nyre) rørelementene fra Drosophila melanogaster. I tillegg til bruken av ione-spesifikke elektroder måler natrium- og kaliumkonsentrasjoner i den utskilte væske, slik at beregningen av transepitelial ionefluks, er beskrevet.

Abstract

Modulering av renal epitel ionetransport tillater organismer for å opprettholde ionisk og osmotisk homeostase i møte med varierende ytre forhold. Drosophila melanogaster Malpighian (nedsatt) tubuli tilbyr en enestående mulighet til å studere de molekylære mekanismene for epitel ion transport, på grunn av den kraftige genetikk av denne organismen og tilgjengeligheten av sine nyretubuli til fysiologisk undersøkelse. Her beskriver vi bruken av Ramsay assay for å måle fluid sekresjon av priser fra isolerte flue renale tubuli, ved anvendelse av ione-spesifikke elektroder for å måle natrium- og kalium-konsentrasjoner i den utskilte væske. Denne analyse tillater studium av transepitelial fluid og Ion fluksene av ~ 20 rørelementer på en gang, uten behov for å overføre utskilte væske til en separat anordning for å måle ion-konsentrasjoner. Genetisk distinkte tubuli kan analyseres for å vurdere rollen til spesifikke gener i transportprosesser. I tillegg, bathing saltvann kan endres for å undersøke effekten av sine kjemiske egenskaper, eller medisiner eller hormoner lagt til. I sammendrag, tillater denne teknikken den molekylære karakterisering av grunnleggende mekanismer for epitel ionetransport i Drosophila tubuli, samt regulering av disse transportmekanismer.

Introduction

Nedsatt epitel ion transport til grunn organisme ione- og osmoregulering. Drosophila melanogaster Malpighian (nedsatt) tubuli tilbyr en enestående mulighet til å studere de molekylære mekanismene for epitel ion transport. Dette skyldes kombinasjonen av kraftige genetikk av Drosophila, sammen med tilgjengeligheten av sine nyretubuli til fysiologisk undersøkelse. The Ramsay analysen, oppkalt etter etterforsker som pioner teknikken ^en måler fluidsekresjon priser fra isolerte Malpighian tubuli, og ble etablert i Drosophila i 1994 av Dow og kolleger ^2. Dette banet vei for videre studier ved hjelp Drosophila genetiske verktøy, for eksempel GAL4-UAS system ^3,4, for å definere celle-spesifikke signalveier som regulerer fluidsekresjon. Et eksempel inkluderer kalsiumsignalisering i respons til et peptidhormon ^5, blant mange andre ^6,7.

ve_content "> En kombinasjon av genetiske teknikker og klassiske fysiologiske studium har vist at urinproduksjonen i fore fly gjennom sekresjon av et kaliumklorid-rik væske fra den største delen av rørelementet. Dette skjer gjennom parallell transepitelial sekresjon av kationer, i første rekke K ⁺ Na ^+, men også gjennom hovedcellen, og Cl ^-. sekresjon gjennom stel cellen ^8-12 Muligheten for separat å måle transepitelial K ⁺ og Na ⁺ fluks gir en mer detaljert karakterisering av transportmekanismer enn måling av fluidsekresjon alene. For eksempel, i ikke-stimulerte Drosophila tubuli, Na ⁺ / K ⁺ -ATPase-inhibitoren ouabain har ingen virkning på væske sekresjon ^2, selv når dens opptak i primære celler inhiberes av det organiske anion transporter inhibitor taurocholat ^13. Imidlertid, og Linton O'Donnell viste at ouabain depolarisererden basolaterale membran potensial, og øker Na ⁺ fluks ^9. Som vist i de representative resultater, vi kopiert disse funnene, og viste at K ⁺ flux er samtidig redusert ^14; økt Na ⁺ flux og redusert K ⁺ flux har motstridende effekter på fluidsekresjon, noe som resulterer i ingen netto endring i sekret. Således er det to oppløsninger til de "ouabain paradoks", dvs. den opprinnelige observasjonen som ouabain har noen effekt på fluidsekresjon i Drosophila tubuli. Første, i stimulerte tubuli, er ikke tydelig effekten av ouabain på fluidsekresjon grunn dens opptak i det organiske anion transporter ^13; og andre, i unstimulated tubuli, ouabain har motstridende effekter på transepitelial Na ⁺ og K ⁺ flux, som resulterer i ingen netto endring i fluidsekresjon (se Representative Resultater og ref. 9). Derfor den primære rolle Na ⁺ / K ⁺ -ATPase i ustimulerte tubuli er å senke intracellulær Na ^{+ -konsentrasjon} å generere en gunstig konsentrasjonsgradient for Na ⁺ -koblet transportprosesser over basolaterale membran. Faktisk, ved separat måling Na ⁺ og K ⁺ flukser, viste vi at tubuli mangler fly natrium-kalium-to-klorid kotransporter (NKCC) har sunket transepitelial K ⁺ flux, uten ytterligere nedgang etter ouabain tillegg og ingen endring i transepitelial Na ⁺ flux ^14. Disse funnene støtter vårt konklusjon at Na ⁺ inn i cellen gjennom NKCC resirkuleres via Na ⁺ / K ⁺ -ATPase. I et annet eksempel Ianowski et al., Observert at senking bad K ⁺ konsentrasjon fra 10 mM til 6 mM redusert transepitelial K ⁺ fluks og øket transepitelial Na ⁺ fluksen i tubuli fra Rhodnius prolixus, med ingen netto endring i fluidsekresjon <sup> 15. Forskjellige effekter på Na ⁺ flux og K ⁺ flux over larve tubuli har også blitt observert i Drosophila tubuli i respons til varierende salt dietter ¹⁶ og i to myggarter som svar på stell saltholdighet ^17.

Den største utfordringen i målingen av transepitelial ionefluks i Ramsay analysen forberedelse er bestemmelse av ionekonsentrasjoner innenfor utskilt væske. Denne utfordringen har blitt møtt med varierende løsninger, inkludert flamme photometery ^18, bruk av radioaktive ioner ^19, og elektron probe bølgelengde spredning spektroskopi ^20. Disse teknikkene krever overføring av det utskilte fluid fallet til et instrument for måling av ion-konsentrasjoner. Siden volumet av væske som utskilles av den ustimulerte Drosophila tubuli er liten, typisk ~ 0,5 nl / min, utgjør dette en teknisk utfordring og også introduserer feil hvis noe av det utskilte fluid ertapt ved overføring. I motsetning til dette tillater bruken av ione-spesifikke elektroder til måling av ioneaktivitet (som ion-konsentrasjon kan beregnes) in situ. Den nåværende protokoll ble tilpasset fra det som brukes av Maddrell og kolleger til å måle transepitelial K ⁺ fluks over Rhodnius tubuli ved hjelp valinomycin som ionofor K ^{+ 21,} og også beskriver bruk av en 4-tert–butylcalix [4] aren-tetraeddiksyre tetraetyl-ester-baserte Na ⁺ -spesifikk ione-spesifikke elektroder kjennetegnet ved Messerli et. al. ^22. Ion-spesifikke elektroder har også blitt brukt til å måle ionekonsentrasjoner i væske som skilles ut av Malpighian tubuli i Ramsay analysen i voksen ^9,23 og larve ¹⁶ Drosophila melanogaster, New Zealand Alpine Weta (Hemideina maori) ²⁴ og mygg ^17.

Her beskriver vi i detalj ved bruk av Ramsay såsi å måle fluid sekresjon priser i Malpighian tubuli fra Drosophila melanogaster, samt anvendelse av ione-spesifikke elektroder for å bestemme konsentrasjonene av K ⁺ og Na ⁺ i den utskilte væske og dermed beregningen av transepitelial ion flukser. En oversikt av analysen er gitt i figur 1.

Figur 1. Skjematisk av Malpighian Drikkerør og Ramsay analysen med bruk av Ion-spesifikke Elektroder måle ionekonsentrasjoner. Denne figuren illustrerer oppsettet for Ramsay analysen. (A) Hver flue har fire rør, et par av fremre tubuli og et par bakre rør, som flyter i bukhulen omgitt av hemolymph. I hvert par, de to tubuli delta på ureter, som munner da urinen i krysset midgut og hindgut. Rørelementene er blind-avsluttet. Urin genereres av fluid-sekresjon hovedsegmentet (vist i rødt), og strømmer mot ureter og ut i tarmen. Etter disseksjon, er tubule paret skilt fra tarmen ved transecting ureter. (B) De to rørelementene blir deretter overført til en dråpe av badesaltløsning inne i en brønn av analysen fatet. En av de to rørelementene, referert til her som "anker tubuli," er viklet rundt en metallstift, og er inert. Den andre tubuli er sekresjon tubuli. Den innledende segment (som ikke skiller ut væske) og hovedsegmentet av de som utskiller tubuli forblir i dråpen av badesaltløsning. Ioner og vann flytte fra bade saltvann og inn i tubulære lumen av hovedsegmentet, og deretter bevege seg mot ureter, som ville oppstå in vivo. Den nedre segment (blå) er utenfor bade saltvann og derfor inert. Siden ureter er kuttet, framgår det utskilte fluid som en dråpe fra den kappede enden av ureter. THan utskilt væske dråpe forstørrer over tid som sekresjon fortsetter, og dens diameter er målt ved hjelp av et okular mikrometer. Et lag av mineralolje hindrer fordampning av det utskilte fluid. Referanse- og ion spesifikke elektroder måler ion konsentrasjonen av utskilt væske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

1. Klar disseksjon, kalibrering og analyse Retter Merk: I dette trinnet, blir tre plastpetriskåler foret med silikon-elastomer fremstilt: en for disseksjon, en for utførelse av Ramsay-analysen ("assay retten"), og en for å utføre kalibrering. Disse rettene er gjenbrukt fra eksperiment for å eksperimentere, og dermed dette trinnet må gjentas hvis en tallerken pauser. Et bilde av assay fatet er vist i figur 2. <p class="jove_content" fo…

Representative Results

Figurene 7 og 8 viser at bruk av Ramsay analysen med ion-spesifikke elektroder for å måle K + og Na + konsentrasjoner kan skille genetisk og farmakologisk tydelig K + og Na + flukser, informasjon som ikke fanges opp ved å måle fluidsekresjon priser alene. Figur 7 viser at redusert fluidsekresjon i tubuli mot fluer som bærer en homozygot null mutasjon i NKCC drives av en reduksjon i K + fluks i mutanter (figur 7A),</stro…

Discussion

Bruken av Ramsay analysen sammen med ione-spesifikke elektroder, muliggjør målingen av fluidsekresjon rater og ion flukser i isolert insekt Malpighian (renale tubuli). Tyve eller flere av rørelementene kan analyseres på en gang, slik at høyere gjennomstrømning i forhold til analysen av individuelle in vitro microperfused tubuli. I tillegg, ione-spesifikke elektroder tillater bestemmelse av ionekonsentrasjoner i den utskilte væske in situ, noe som begrenser feil som kan innføres i overføringen …

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.