A utilização do Ramsay ensaio para medir secreção de fluidos e Ion Flux Preços no<em> Drosophila melanogaster</em> Tubule Malpighian

Summary

Este protocolo descreve a utilização do ensaio de Ramsay para medir as taxas de secreção de fluidos de Malpighi (túbulos renais) isolado a partir de Drosophila melanogaster. Além disso, a utilização de eléctrodos específicos de iões para medir as concentrações de sódio e potássio no líquido segregado, que permite o cálculo do fluxo de iões transepitelial, é descrito.

Abstract

Modulação de transporte iónico epitelial renal permite que os organismos para manter a homeostase iónica e osmótica na face da variação das condições externas. A Drosophila melanogaster Malpighian (renal) túbulo oferece uma oportunidade única para estudar os mecanismos moleculares de transporte de íons epitelial, devido à genética poderosas deste organismo e da acessibilidade dos seus túbulos renais para estudo fisiológico. Aqui, nós descrevemos o uso do ensaio de Ramsay para medir as taxas de secreção de fluidos a partir de isolado de moscas túbulos renais, com a utilização de eléctrodos específicos de iões para medir as concentrações de sódio e potássio em que o fluido segregado. Este ensaio permite o estudo de fluidos e de iões transepitelial fluxos de ~ 20 túbulos de cada vez, sem a necessidade de transferir o fluido segregado a um aparelho separado para medir as concentrações de iões. Túbulos geneticamente distintas podem ser analisados ​​para avaliar o papel de genes específicos em processos de transporte. Além disso, o bathing salina pode ser modificado para analisar os efeitos das suas características químicas, ou drogas ou hormonas acrescentados. Em resumo, esta técnica permite a caracterização molecular dos mecanismos básicos de transporte epitelial de iões no túbulo Drosophila, bem como a regulação destes mecanismos de transporte.

Introduction

Transporte de íons epitelial renal subjacente iono- organismal e osmoregulation. A Drosophila melanogaster Malpighian (renal) túbulo oferece uma oportunidade única para estudar os mecanismos moleculares de transporte de íons epitelial. Isto é devido à combinação dos poderosas da genética de Drosophila, emparelhado com a acessibilidade dos seus túbulos renais para estudo fisiológico. O ensaio de Ramsay, em homenagem ao pesquisador que foi pioneiro na técnica ^1, mede as taxas de secreção de fluidos de túbulos de Malpighi isolados, e foi criada em Drosophila em 1994 pela Dow e colegas ^2. Isso pavimentou o caminho para novos estudos utilizando Drosophila ferramentas genéticas, tais como o sistema GAL4-UAS ^3,4, para definir específico de células vias de sinalização que regulam a secreção de fluidos. Um exemplo inclui a sinalização de cálcio, em resposta a uma hormona peptídica, ^{5, 6,7,} entre muitos outros.

ve_content "> uma combinação de técnicas genéticas e estudo fisiológico clássica demonstrou que a geração de urina na mosca ocorre através da secreção de um líquido rico em cloreto de potássio a partir do segmento principal do túbulo. Isto ocorre através da secreção transepitelial paralelo de catiões, principalmente ^K + ^Na +, mas também, através da célula principal, e Cl ^-. através da secreção de células estreladas ^8-12 A capacidade de medir separadamente transepiteliais K ⁺ e Na ⁺ fluxos permite uma caracterização mais detalhada dos mecanismos de transporte do que a medição da secreção de fluido sozinho. Por exemplo, nos túbulos de Drosophila não estimuladas, a ^Na + / ^K + -ATPase ouabaína não tem efeito sobre a secreção de ^fluido 2, mesmo quando a sua absorção em células principais é inibida pelo inibidor de transportador aniónico taurocolato orgânica ^13. No entanto, e Linton O'Donnell mostrou que a ouabaína despolarizao potencial da membrana basolateral, e aumenta o fluxo ^de Na + ^9. Como mostrado nos resultados representativos, nós replicado estes achados, e mostrou que K ⁺ fluxo é concomitantemente diminuiu ^14; o aumento do fluxo de ^Na + e diminuição do K ⁺ fluxo têm efeitos opostos sobre a secreção de fluido, resultando em nenhuma alteração na secreção de líquido. Assim, existem duas resoluções para o "paradoxo ouabaína," ou seja, a observação inicial de que a ouabaína não tem efeito sobre a secreção de fluido no túbulo Drosophila:. Em primeiro lugar, nos túbulos estimulada, o efeito de ouabaína na secreção de fluido não é aparente devido à sua absorção pelo transportador de aniões orgânicos ^13; e, segundo, nos túbulos não estimuladas, ouabaína tem efeitos sobre transepithelial ^Na + e K ⁺ fluxo opostas, resultando em nenhuma alteração líquida na secreção de fluidos (ver resultados representativos e ref. 9). Portanto, o principal papel do ^Na + / K ⁺ -ATPase nos túbulos não estimuladas é o de diminuir a concentração intracelular ^de Na + para gerar um gradiente de concentração ^de Na + para o favorável -coupled processos de transporte através da membrana basolateral. Com efeito, medindo em separado ^de Na + e K ⁺ fluxos, nós demonstramos que túbulos que falta o co-transportador de mosca de sódio-potássio-2-cloreto de (CCAN) diminuíram K transepitelial ⁺ fluxo, sem diminuição adicional após a adição de ouabaína, e nenhuma alteração em transepitelial ^Na + fluxo ^14. Estes resultados suportada nossa conclusão de que ^o Na + que entra na célula através da CCAN é reciclado através do ^Na + / ^K + -ATPase. Em outro exemplo, Ianowski et al., Observaram que a redução da concentração do banho ^de K + de 10 mM a 6 mM de ^K + diminuiu transepitelial fluxo transepitelial e aumentou o fluxo ^de Na + nos túbulos de Rhodnius prolixus, sem alteração líquida no fluido de secreção <sup> 15. Efeitos diferenciais de fluxo ^de Na + e K ⁺ fluxo através dos túbulos de larvas também têm sido observadas em túbulos de Drosophila em resposta a diferentes dietas de sal ¹⁶ e em duas espécies de mosquitos em resposta à criação de salinidade ^17.

O maior desafio na medição de fluxo de iões transepitelial na preparação de ensaio Ramsay é a determinação das concentrações de iões dentro do fluido segregado. Este desafio foi cumprido com soluções diferentes, incluindo photometery chama ^18, o uso de íons radioativos ^19, e eletrônica sonda comprimento de onda espectroscopia por dispersão de ^20. Estas técnicas exigem transferência da gota líquido secretado a um instrumento para a medição de concentrações de íons. Uma vez que o volume de fluido que é segregado pelo túbulo Drosophila não estimulado é pequena, tipicamente ~ 0,5 nl / min, isto representa um desafio técnico e também introduz erro se algum do fluido é segregadaperdeu por ocasião da transferência. Em contraste, a utilização de eléctrodos específicos de iões permite a medição da actividade de iões (a partir do qual a concentração de iões pode ser calculado) in situ. O protocolo corrente foi adaptada da utilizada por Maddrell e colegas para medir transepitelial ^K + fluxo através do túbulo Rhodnius usando valinomicina como o ^K + ionóforo ^21, e também descreve a utilização de um -butylcalix 4- terc [4] areno-ácido tetraacético tetraetil éster à base de ^Na + eléctrodo específico de iões espec�ico caracterizado por Messerli et. al. ^22. Eletrodos íon-específicas também têm sido usados ​​para medir concentrações de íons no líquido secretado por túbulos de Malpighi no ensaio Ramsay em ^9,23 adulto e ¹⁶ larval Drosophila melanogaster, a Nova Zelândia Alpine Weta (Hemideina ^maori) 24 e ¹⁷ em mosquitos.

Aqui, descrevemos em detalhes o uso do Ramsay comodizer para medir as taxas de secreção de fluidos em túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster, bem como o uso de eletrodos de íon-específico para determinar as concentrações de K ⁺ e ^Na + dentro do fluido secretado e, portanto, o cálculo dos fluxos de iões transepithelial. Uma visão geral do ensaio é fornecida na Figura 1.

Figura 1. Esquema do Malpighian Palhinha eo Ramsay Ensaio com uso de íon-específicas eletrodos para medir concentrações de iões. Esta figura ilustra a configuração para o ensaio Ramsay. (A) Cada mosca tem quatro túbulos, um par de túbulos anterior e um par de túbulos posteriores, que flutuam na cavidade abdominal cercado por hemolinfa. Em cada par, as duas túbulos juntar-se no ureter, que, em seguida, esvazia-se a urina na junção do intestino médio e hindgut. Os túbulos são cegos-ended. A urina é gerado pelo segmento principal secretor de fluido (representado em vermelho), e flui para fora do ureter e no intestino. Após dissecção, a par dos túbulos é dissociada do intestino, ao seccionar o ureter. (B) A par dos túbulos é então transferida para uma gota de solução salina de banho dentro de uma cavidade do prato de ensaio. Um dos dois túbulos, referido aqui como o "túbulo âncora", é enrolado em torno de um pino de metal e é inerte. A outra é o túbulo túbulo secretora. O segmento inicial (que não secretam fluido) e segmento principal do túbulo segregam permanecer dentro da gotícula de solução salina de banho. Íons e movimento de água da salina de banho e para o lúmen do túbulo do segmento principal, em seguida, avançar em direção ao ureter, como ocorreria in vivo. O segmento inferior (azul) está fora da salina de banho e, portanto, inertes. Uma vez que o ureter é cortado, o fluido segregado surge como uma gota a partir da extremidade de corte do ureter. Tele secretada gota de fluido aumenta ao longo do tempo como a secreção continua, e o seu diâmetro é medido usando um micrómetro ocular. Uma camada de óleo mineral evita a evaporação do fluido que é segregado. Os eletrodos de referência específicas e de iões de medir a concentração de íons do fluido secretado. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocol

1. Preparar a dissecção, calibração e de ensaio Pratos Nota: Neste passo, os três pratos de Petri de plástico revestidas com o elastómero de silicone são preparados: um para dissecção, uma para realizar o ensaio de Ramsay ("ensaio de prato"), e uma para realizar a calibração. Estes pratos são re-utilizado de experiência para experiência, e, assim, este passo apenas necessita de ser repetida, se um prato quebras. Uma imagem do prato de ensaio é mostrada n…

Representative Results

As Figuras 7 e 8 demonstram que a utilização do ensaio de Ramsay com eléctrodos específicos de iões para medir as concentrações de K + e Na + pode distinguir geneticamente e farmacologicamente distintas K + e fluxos de Na +, a informação que não é capturada medindo as taxas de secreção de fluidos sozinho. Figura 7 mostra que a diminuição da secreção de fluido nos túbulos de moscas que transportam uma mutação nula homozigót…

Discussion

A utilização do ensaio de Ramsay, em conjunto com eletrodos íon-específico, permite a medição das taxas de secreção de fluidos e fluxos de iões em insetos isolado Malpighi (renais) túbulos. Vinte ou mais túbulos pode ser ensaiada de cada vez, permitindo que um maior rendimento em comparação com o ensaio in vitro de indivíduo microperfused túbulos. Além disso, os eléctrodos específicos de iões permitir a determinação das concentrações de iões dentro do fluido que é segregado in situ,…

Materials

Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	http://www.ellsworth.com/dow-corning-sylgard-184-silicone-encapsulant-0-5kg-kit-clear/	May be purchased from multiple distributors
Petri dish, polystyrene, 100 mm x 15 mm	Fisher	FB0875712	Specific brand is not important
Petri dish, polystyrene, 35 mm x 10 mm	Corning Life Sciences	Fisher 08-757-100A	Specific brand is not important
Scalpel Handle #3	Fine Science Tools	10003-12	Specific brand is not important
Scalpel Blades #1	Fine Science Tools	10011-00	Specific brand is not important; use appropriate sharps precautions
Needle, 30G x 1/2	Becton Dickinson	305106	Use appropriate sharps precautions
Minutien pins, black anodized, 0.15 mm	Fine Science Tools	26002-15
Stereomicroscope with ocular micrometer	Nikon	SMZ800	Specific brand is not important; this is given as an example
Sheet of black stained glass, 3 mm (1/8 inch) thick	Hobby shop		Example includes Spectrum Black Opal by Spectrum Glass (http://www.delphiglass.com/spectrum-glass/opalescent/spectrum-black-opal)
Glass cutting tools (glass cutter, glass cutting pliers)	Hobby shop		Examples include the Studio Pro Lightweight Running Pliers by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/pliers-nippers/studio-pro-lightweight-running-pliers) and the Studio Pro Brass Glass Cutter by Diamond Tech (http://www.delphiglass.com/glass-cutters-tools/glass-cutters/studio-pro-brass-glass-cutter). Use appropriate safety precautions when cutting glass
Borosilicate glass capillary tube, unfilamented, GC120-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0042
Borosilicate glass capillary tube, filamented, GC120F-10, OD 1.2 mm, ID 0.69 mm, length 10 cm	Warner Instruments	30-0044
Nitric acid, 70%	Sigma	438073	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines. Specific brand is not important
Cimarec 7 in x 7 in hotplate	Fisher	11675911Q	Specific brand is not important; caution when heated
Selectophore dichlorodimethylsilane	Sigma	40136-1ML	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Two-step vertical pipet puller	Narishige	PC-10	Other pipet pullers can be used; this is given as an example
Glass petri dish, 150 mm diameter x 15 mm height	Fisher	08-748E	Specific brand is not important; only one dish needed
World Precision Instruments E210 1 mm micropipette storage jar	Fisher	50-821-852	May be available from other distributors. Useful to have two jars. Note that although this jar is specified for 1 mm pipets, and the pipets used here are 1.2 mm, in our experience the 1 mm jar works best for the 1.2 mm pipets.
Silica Gel, Tel-Tale Desiccant, indicating, 10-18 mesh	Fisher	S161-500	Indicating silica useful for determining whether silica gel retains desiccating ability
World Precision Instruments MicroFil, 34G	Fisher	50-821-914	May be available from other distributors.
1 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309659	May be available from other distributors.
3 ml syringe with luer lock	Becton Dickinson	309657	May be available from other distributors.
D300 3-way stopcock with female luer lock inlet port, male luer outlet port with rotating collar and guard	Cole-Parmer	UX-30600-02	Specific brand is not important
Female Luer Locking Connector	4 Medical Solutions	ADC 9873-10	Specific brand is not important; barbed end is ~4 mm at narrowest point and ~7 mm at widest point.
Silicone Tubing I.D. x O.D. x Wall: 1/16 x 1/8 x 1/32 in. (1.59 x 3.18 x 0.79 mm)	Fisher	14-179-110	Specific brand is not important
E-3603 tubing, I.D. x O.D.: 1/32 x 3/32 in	Fisher	14171208	Specific brand is not important
Modeling clay			Specific brand is not important
Selectophore potassium ionophore I, cocktail B	Sigma	99373	CAUTION: see Material Data Safety Sheet for appropriate storage and handling guidelines
Selectophore sodium ionophore X	Sigma	71747	Sodium ionphore X = 4-tert-butylcalix[4]arene-tetraacetic acid tetraethylester
Selectophore 2-nitrophenyl octyl ether	Sigma	73732
Selectophore sodium tetraphenylborate	Sigma	72018
Schneider's Drosophila medium	Life Technologies	21720024
High impedance electrometer	World Precision Instruments	FD223a
Microelectrode holder 1 mm with 45° body, vented, with handle	Warner Instruments	64-1051
Microelectrode holder 1 mm with straight body, vented	Warner Instruments	64-1007
Silver wire	Warner Instruments	64-1318
Micromanipulators, pair	Leitz		Various brands/models will work; this is an example
Faraday cage	Technical Manufacturing Corporation	81-334-03	This is an example; any Faraday cage will work
Single gooseneck fiberoptic light	Nikon		Specific brand is not important
mineral oil	Fisher	BP-2629	Specific brand is not important
forceps, Dumont #5 with Biologie tip	Fine Science Tool	11295-10	May be available from other distributors.