Identification des bactéries pathogènes rares par 16S ARNr Gene Séquençage et MALDI-TOF MS

Summary

Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.

Abstract

Il y a un certain nombre d'agents pathogènes bactériens rares et, par conséquent, décrit insuffisamment qui sont signalés à causer des infections graves en particulier chez les patients immunodéprimés. Dans la plupart des cas, seules quelques données, pour la plupart publiées sous forme de rapports de cas, sont disponibles qui enquête sur le rôle de ces agents pathogènes comme un agent infectieux. Par conséquent, afin de clarifier le caractère pathogène de ces micro-organismes, il est nécessaire de mener des études épidémiologiques qui comprennent un grand nombre de ces bactéries. Les méthodes utilisées dans cette étude de surveillance doivent répondre aux critères suivants: l'identification des souches doit être précise selon la nomenclature en cours de validité, ils devraient être faciles à manipuler (robustesse), économique dans le diagnostic de routine et ils doivent générer comparables les résultats entre les différents laboratoires. En général, il existe trois stratégies pour identifier des souches bactériennes dans un cadre de routine: 1) l'identification phénotypique caractérisant le Biochemical et métaboliques propriétés des bactéries, 2) les techniques moléculaires telles que le séquençage du gène ARNr 16S et 3) la spectrométrie de masse comme une approche basée roman protéome. Etant donné que la spectrométrie de masse et les approches moléculaires sont les outils les plus prometteurs pour l'identification d'une grande variété d'espèces bactériennes, ces deux méthodes sont décrites. Les progrès, les limites et les problèmes potentiels lors de l'utilisation de ces techniques sont discutées.

Introduction

Identification sécurisée des agents pathogènes rares dans le diagnostic de routine est entravée par le fait que les méthodes culturales et biochimiques classiques sont encombrants et parfois discutable. En outre, un laboratoire de microbiologie diagnostique doit traiter un grand nombre d'agents pathogènes, allant de quelques centaines à plusieurs milliers par jour, ce qui nécessite l'utilisation de systèmes automatisés. En plus de la gestion d'un débit journalier élevé, l'identification précise des espèces bactériennes est nécessaire. Cela est justifié car ils diffèrent dans leur modèle de sensibilité aux antimicrobiens et l' identification correcte fournit donc le clinicien des informations essentielles pour choisir les antibiotiques appropriés (par exemple, Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) ^12,43.

systèmes d'identification microbienne automatisée (MUAS) appliquent un ensemble normalisé de réactions enzymatiques pour caractériser les propriétés métaboliques des isolats bactériens <sup> 13,15,16,26,27. Bien que les cartouches utilisées dans ces systèmes utilisent un grand nombre de différentes réactions biochimiques, par exemple, 47 dans la carte GN du MUAS utilisé dans cette étude ^52, ce permis de stratégie identification sécurisée seulement pour un ensemble limité de bactéries. En outre, la base de données, un système expert avancé, est clairement axé sur la détection de bactéries pertinentes et hautement pertinentes d'importance médicale ^13,15,16,36. Deux autres systèmes, largement utilisés dans les laboratoires, appliquent également cette approche biochimique pour l'identification bactérienne. Des études récentes démontrent une précision d'identification comparable entre les MUAS utilisés dans cette étude et l' un des concurrents (93,7% et 93,0% respectivement), tandis que le 3 ^ème MUAS a une précision d'identification de seulement 82,4% sur les espèces de niveau ^35. Ces écarts peuvent être expliqués par la qualité des références de données d'identification sous-jacentes, les versions de kits et de logiciels, les différences de metabolisme et la compétence du personnel technique ^35,36.

Deux systèmes automatisés MALDI-TOF MS (MALDI-TOF système d'identification microbienne, IHMs) sont principalement utilisés. Ces systèmes permettent la détection d'un grand nombre d'espèces bactériennes en fonction de leurs spectres de masse des protéines d'empreintes digitales. Par exemple, la base de données des IHMs utilisées contient des spectres de référence 6000. Les systèmes d'identification basés sur la spectrométrie de masse offrent une détection rapide et fiable d'une grande variété de micro – organismes , y compris les agents pathogènes rares ^11,48,51. À ce jour , seulement quelques comparaisons directes sont disponibles entre les IHMs utilisés dans cette étude et son concurrent ^19,33. Selon Daek et al. Les deux systèmes offrent un taux de précision de l' identification similaire élevé, mais les IHMs utilisés dans cette étude semble être plus fiable dans l' identification des espèces ^19.

gènes distincts De même, les techniques moléculaires adressage bien conservées mais aussi ( <em> par exemple, ADNr 16S ou rpoB) permettent une identification claire des espèces ^3,22,61. Parmi ceux – ci, l'ADNr 16S est le gène le plus largement utilisé de ménage en raison de sa présence dans toutes les bactéries ^34. Sa fonction reste inchangée et , finalement, avec environ 1 500 pb, il est assez long pour être adapté à la bio-informatique ^14,34. De nombreux chercheurs considèrent ARNr 16S analyse génétique comme «étalon-or» pour l' identification bactérienne ^21. Cela est dû au fait que quelques laboratoires utilisent des techniques d'hybridation ADN-ADN à ce jour pour l' identification des rares ou nouvelles bactéries ^14,34. En outre, de plus en plus des bases de données sont disponibles qui peuvent être utilisés pour l' analyse de l' ARNr 16S des gènes ^50. Cependant, il doit être pris en compte que les systèmes de détection basés sur l'ADNr 16S ont une sensibilité limitée par rapport aux protocoles de PCR standard. En outre, l'approche moléculaire est sophistiquée, du temps et nécessite un personnel hautement qualifié, ainsi queinstallations de laboratoire dédiées et est, par conséquent, pas facilement mis en œuvre dans le diagnostic de routine ^55. En outre, il a été montré que la combinaison d'au moins deux procédés différents d'identification des bactéries conduit à l'identification des souches très précis. La combinaison de séquençage MALDI-TOF MS et ADNr 16S permet d'identifier un grand nombre de différentes espèces bactériennes avec une grande précision. Récemment , la combinaison de l' analyse du gène MALDI-TOF MS et ARNr 16S a été présenté pour l' identification bactérienne étudier les questions épidémiologiques et des agents pathogènes rares ^56.

Protocol

1. Extraction de l'ADN bactérien Préparation de la solution PBS Peser 1,65 g de Na 2 HPO 4 x 2H 2 O, 0,22 g de NaH 2 PO 4 x 2H 2 O et 8,80 g de NaCl dans un flacon et remplir avec de l' eau distillée jusqu'à un volume final de 1000 ml. Ajuster le pH à 7,4. Pour utilisation finale filtrer la solution à travers une bactérie résistant (0,22 um) filtre. Les bactéries d'extraction d'ADN de ba…

Representative Results

MALDI-TOF MS est une nouvelle méthode rapide et peu coûteuse pour le diagnostic de routine microbiologiques. Bactérienne identification des espèces par MALDI-TOF MS produit des spectres principalement composé de protéines ribosomiques , mais aussi d' autres "protéines très conservées avec des fonctions internes de maintien affectés dans une mesure minimale par les conditions environnementales" 17 base de données .La de cette MMIS contient un grand nomb…

Discussion

Deux MALDI-TOF et le séquençage du gène de l'ARNr 16S offrent la possibilité d'identifier un grand nombre de bactéries différentes. MALDI-TOF MS est une méthode rapide et peu coûteuse, qui est facile à manipuler et de grandes bases de données de spectres de masse bactérienne sont disponibles. Pour cette raison, MALDI-TOF MS est un coût moyen rapide, efficace et fiable pour mener des études de dépistage axés sur les bactéries pathogènes rares ^17,20,39,51. Dans une étude prospective co…

Materials

CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	270733
Tissue Lyser LT	Qiagen, Hilden, Germany	85600	Oscillating Homogenizer
Glass-beads 1,0mm	VWR International, Darmstadt, Germany	412-2917
Thermomixer 5436	Eppendorf, Hamburg, Germany	2050-100-05
QIAamp DNA Mini Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	51306
Taq PCR Core Kit (1000 U)	Qiagen, Hilden, Germany	201225
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’)	biomers.net GmbH, Ulm, Germany	–
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´)	biomers.net GmbH, Ulm, Germany	–
Mastercycler	Eppendorf, Hamburg, Germany	-	Thermocylcer
Reaction tube 1.5 mL	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,692
Reaction tube 2 mL	SARSTEDT, Nümbrecht, Germany	72,693,005
PCR 8er-CapStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711040X
PCR 8er-SoftStrips	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	711030X
Sharp R-ZV11	Sharp Electronics, Hamburg, Germany	–	Microwave
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg)	Merck, Darmstadt, Germany	1084211000
SeaKem LE Agarose	Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany	849006
(2 x 500 g)
SmartLadder SF – 100 to 1000 bp	Eurogentec, Lüttich, Belgium	MW-1800-04
Bromphenol blue (25 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	B0126
Xylene cyanol FF (10 g)	Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany	X4126
ComPhor L Maxi	Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany	–
Ethidium bromide solution 1 %(10 mL)	Carl Roth, Karlsruhe, Germany	2218.1
Gel Doc 2000	Bio-Rad Laboratories, München, Germany	–	Gel-documentation system
ExoSAP-IT (500 reactions)	Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom	78201
Buffer (10 x) with EDTA	Life Technologies, Darmstadt, Germany	402824
BigDye Terminator Kit v1.1	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4337450
Hi-Di formamide (25 mL)	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4311320
DyeEx 2.0 Spin Kit (250)	Qiagen, Hilden, Germany	63206
3130 Genetic Analyzer	Life Technologies, Darmstadt, Germany	–	Sequenzer
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4306737
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317237
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4317241
3130 Genetic Analyzer, well plate septa	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4315933
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4352759
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm	Life Technologies, Darmstadt, Germany	4333466
Sequencing Analysis Software 5.4	Life Technologies, Darmstadt, Germany	–
microflex (the MALDI TOF MS maschine)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–
MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–	our mMIS
VITEK MS	bioMérieux, Nürtingen, Germany		2nd mMis
flexControl 3.4 (control software)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software)	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	–
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	201344
Peptide Calibration Standard II	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	222570
MSP 96 target polished steel	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	8224989
peqgreen	peqlab	37-5010
MALDI Biotyper Galaxy	Bruker Daltonik, Bremen, Germany	Part No. 1836007
Vitek 2	bioMérieux, Nürtingen, Germany		our aMis
MicroScan	Beckman Coulter		2nd aMis
BD Phoenix™ Automated Microbiology System	BD		3rd aMis
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™)	ATCC		postive control for PCR