16S rRNA의 유전자 시퀀싱과 MALDI-TOF MS에 의해 희귀 세균성 병원체의 식별
Summary
Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.
Abstract
특히 면역 환자에서 심각한 감염을 일으킬 것으로보고되고 있으므로, 충분히 설명 된 희귀 세균성 병원체가 있습니다. 대부분의 경우 보고서로 게시 대부분의 경우 단지 몇 데이터,에서, 감염원과 같은 병원균의 역할을 조사 할 수 있습니다. 따라서, 병원성 미생물의 특성을 명확하게하기 위해, 이들 박테리아의 다수를 포함 역학 조사를 수행 할 필요가있다. 균주의 확인은, 그들이 루틴 진단 (견고성) 취급하기 쉽고 경제적이어야 유효 명명법에 따른 정확성을 가지며, 이들은 비교 생성 할 : 이러한 감시 연구에서 사용되는 방법은 다음 조건을 만족해야 다른 실험실 중 결과. 일반적으로, 일상적인 환경에서 박테리아 균주를 식별하기위한 세 가지 전략이있다 같습니다 biochemica의 특성 1) 표현형 식별박테리아 L 및 대사 특성 2) 신규 프로테옴 기반 접근법으로서 16S rRNA 유전자 서열 3) 질량 스펙트럼 분자 기법. 질량 분석 및 분자 접근법 박테리아 종의 많은 종류를 식별하기위한 가장 유망한 도구이기 때문에, 이러한 두 가지 방법이 설명된다. 이러한 기술을 사용하여 진행 제한 및 잠재적 인 문제가 논의된다.
Introduction
일상적인 진단에 드문 병원체의 안전 확인은 고전 문화와 생화학 적 방법이 복잡하고 때로는 의심 있다는 사실에 의해 방해된다. 또한, 진단 미생물학 연구소는 자동화 된 시스템의 사용을 필요로 매일 수천에 수백에 이르는 병원균 다수, 처리한다. 높은 일일 처리량의 관리뿐만 아니라, 박테리아 종의 정확한 식별은 필요하다. 그들은 자신의 항균제 감수성 패턴에 차이가 있으므로 올바른 식별 적절한 항생제를 선택하는 중요한 정보 (예를 들어, 엔테로 종., 된 Acinetobacter 종.) 12,43와 임상의를 제공하기 때문에이 보증합니다.
자동 미생물 식별 시스템 (AMIS)는 박테리아 균주의 대사 특성을 특성화하기 위해 효소 반응의 표준 세트를 적용 <sup> 13,15,16,26,27. 이러한 시스템에 사용되는 카트리지는 다양한 생화학 적 반응의 다수, 예를 들어, 52이 연구에 사용 된 AMI의 GN 카드 (47) 만 세균 제한된 전략이 허가 보안 ID를 이용하더라도. 또한, 데이터베이스, 고급 전문가 시스템은 명확 의학적 중요성 13,15,16,36의 관련성 관련성 세균의 검출에 초점을 맞추고있다. 널리 실험실에서 사용되는 두 개의 추가 시스템은 또한 박테리아 식별이 생화학 적 방법을 적용 할 수 있습니다. 종 (35) 수준에서 3 차 AMI를 단지 82.4 %의 식별 정확도를 갖는다 최근의 연구는 본 연구에서 사용 된 AMI와 경쟁 온 (93.7 %는 각각 93.0 %) 사이의 비교 식별의 정확도를 증명한다. 이러한 불일치는 기본 식별 데이터 참조, 키트 및 소프트웨어, 메타 보의 차이 버전의 품질에 의해 설명 될 수있다lism 및 기술 인력 35, 36의 능력.
두 자동화 된 MALDI-TOF MS 시스템 (MALDI-TOF 미생물 식별 시스템, MMIS)이 주로 사용된다. 이 시스템은 단백질 지문 질량 스펙트럼에 기초한 박테리아 종의 다수의 검출을 허용한다. 예를 들어, 사용 된 MMIS의 데이터베이스는 6000 참조 스펙트럼이 포함되어 있습니다. 질량 분석을 기반으로 식별 시스템은 희귀 병원균 11,48,51를 포함하는 미생물의 큰 다양성의 빠르고 안정적인 검출을 제공합니다. 지금까지 몇 직접적인 비교는 본 연구에서 사용 된 MMIS와 경쟁 19,33 사이에 사용할 수 있습니다. Daek 따르면 외. 두 시스템 식별 정확도 유사한 높은 속도를 제공하지만, 본 연구에 사용 된 MMIS 종 식별 19보다 안정적인 것으로 보인다.
마찬가지로, 분자 기술은 또한 잘 보존하지만 주소 지정 고유 한 유전자 ( <em> 예를 들어, 16S rDNA의 또는 rpoB)는 명확한 종 식별 3,22,61을 허용합니다. 이들 중에서, 16S rDNA의 때문에 모든 세균 (34)의 존재에 가장 널리 사용되는 하우스 키핑 유전자이다. 그 기능은 생물 정보학 14, 34에 적합 할만큼 충분히 긴 대략 1,500 염기쌍으로 변경하고 마지막 유지된다. 많은 연구자들은 박테리아 식별 (21)에 대해 "금 표준"등의 16S rRNA 유전자 분석을 간주한다. 이것은 몇몇 실험실 희귀하거나 새로운 박테리아 14, 34 식별하기위한 날짜 DNA-DNA 혼성화 기술을 사용한다는 사실에 기인한다. 또한, 더 많은 데이터베이스는 16S rRNA 유전자 분석 (50)에 이용 될 수 있습니다. 그러나, 16S rDNA의 기반 탐지 시스템은 표준 PCR 프로토콜에 비해 제한된 감도를 가지고 있음을 고려해야한다. 또한, 분자 접근 방식은 많은 시간이 소요, 정교하고 고도로 훈련 된 직원뿐만 아니라 필요전용 실험실 시설이며, 따라서 쉽게 일상적인 진단 (55)에 구현되지. 또한, 세균의 식별 중 적어도 두 가지 방법들의 조합이 고정밀 스트레인 식별에 이르게하는 것이 밝혀졌다. MALDI-TOF MS 및 16S rDNA 염기 서열의 결합은 높은 정밀도로 다른 세균 종의 다수의 식별을 허용한다. 최근 MALDI-TOF MS 및 16S rRNA 유전자 분석의 조합은 역학적 질문 희귀 병원균 세균성 56 공부 식별을 위해 제시되었다.
Protocol
세균 DNA의 추출 (1) PBS 용액의 조제 1.65 g을 플라스크에 2 HPO 4 × 2H 2 O, 0.22 g의의 NaH 2 PO 4 × 2H 2 O 및 8.80 g의 NaCl 나 무게 1,000 ML의 최종 볼륨에 증류수로 채운다. 7.4 pH를 조정합니다. 최종 사용하기 위해 박테리아 방지 (0.22 μm의) 필터를 통해 솔루션을 필터링 할 수 있습니다. DNA의 추출 그람 음성균 킬 적절한 배양 …
Representative Results
MALDI-TOF MS는 소설, 미생물 일상적인 진단을위한 신속하고 저렴한 방법입니다. MALDI-TOF MS에 의해 세균 종 식별이 주로 리보솜 단백질뿐만 아니라 다른 "환경 조건에 의해 최소한의 정도에 영향을 집 유지 기능을 가진 매우 보존 된 단백질"로 구성 스펙트럼을 생산하는이 MMIS의 17 국지적 인 데이터베이스는 기준 스펙트럼의 큰 집합을 포함 거의 임상 분리에서…
Discussion
MALDI-TOF MS 및 16S rRNA 유전자 서열은 모두 다른 박테리아의 다수를 식별 할 수있는 가능성을 제공한다. MALDI-TOF MS는 처리하고 세균 질량 스펙트럼의 대형 데이터베이스를 사용할 수있는 용이 한 빠르고 저렴한 방법입니다. 이러한 이유로, MALDI-TOF MS 희귀 세균성 병원균 17,20,39,51 집중 스크리닝 연구를 수행하기 위해 신속하고 비용 효율적이며 신뢰할 수있는 방법이다. 다른 표현형 식별 방법,…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Prof. Enno Jacobs for his continuing support.
Materials
| CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | 270733 | |
| Tissue Lyser LT | Qiagen, Hilden, Germany | 85600 | Oscillating Homogenizer |
| Glass-beads 1,0mm | VWR International, Darmstadt, Germany | 412-2917 | |
| Thermomixer 5436 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 2050-100-05 | |
| QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen, Hilden, Germany | 51306 | |
| Taq PCR Core Kit (1000 U) | Qiagen, Hilden, Germany | 201225 | |
| Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) | biomers.net GmbH, Ulm, Germany | – | |
| Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) | biomers.net GmbH, Ulm, Germany | – | |
| Mastercycler | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | Thermocylcer |
| Reaction tube 1.5 mL | SARSTEDT, Nümbrecht, Germany | 72,692 | |
| Reaction tube 2 mL | SARSTEDT, Nümbrecht, Germany | 72,693,005 | |
| PCR 8er-CapStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 711040X | |
| PCR 8er-SoftStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 711030X | |
| Sharp R-ZV11 | Sharp Electronics, Hamburg, Germany | – | Microwave |
| Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) | Merck, Darmstadt, Germany | 1084211000 | |
| SeaKem LE Agarose | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 849006 | |
| (2 x 500 g) | |||
| SmartLadder SF – 100 to 1000 bp | Eurogentec, Lüttich, Belgium | MW-1800-04 | |
| Bromphenol blue (25 g) | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | B0126 | |
| Xylene cyanol FF (10 g) | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | X4126 | |
| ComPhor L Maxi | Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany | – | |
| Ethidium bromide solution 1 %(10 mL) | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2218.1 | |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad Laboratories, München, Germany | – | Gel-documentation system |
| ExoSAP-IT (500 reactions) | Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom | 78201 | |
| Buffer (10 x) with EDTA | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 402824 | |
| BigDye Terminator Kit v1.1 | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4337450 | |
| Hi-Di formamide (25 mL) | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4311320 | |
| DyeEx 2.0 Spin Kit (250) | Qiagen, Hilden, Germany | 63206 | |
| 3130 Genetic Analyzer | Life Technologies, Darmstadt, Germany | – | Sequenzer |
| MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4306737 | |
| 3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4317237 | |
| 3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4317241 | |
| 3130 Genetic Analyzer, well plate septa | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4315933 | |
| 3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4352759 | |
| 3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4333466 | |
| Sequencing Analysis Software 5.4 | Life Technologies, Darmstadt, Germany | – | |
| microflex (the MALDI TOF MS maschine) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
| MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | our mMIS |
| VITEK MS | bioMérieux, Nürtingen, Germany | 2nd mMis | |
| flexControl 3.4 (control software) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
| Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
| α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 201344 | |
| Peptide Calibration Standard II | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 222570 | |
| MSP 96 target polished steel | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8224989 | |
| peqgreen | peqlab | 37-5010 | |
| MALDI Biotyper Galaxy | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | Part No. 1836007 | |
| Vitek 2 | bioMérieux, Nürtingen, Germany | our aMis | |
| MicroScan | Beckman Coulter | 2nd aMis | |
| BD Phoenix™ Automated Microbiology System | BD | 3rd aMis | |
| Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) | ATCC | postive control for PCR |
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Schröttner, P., Gunzer, F., Schüppel, J., Rudolph, W. W. Identification of Rare Bacterial Pathogens by 16S rRNA Gene Sequencing and MALDI-TOF MS. J. Vis. Exp. (113), e53176, doi:10.3791/53176 (2016).