Matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) and molecular techniques (16S rRNA gene sequencing) permit the identification of rare bacterial pathogens in routine diagnostics. The goal of this protocol lies in the combination of both techniques which leads to more accurate and reliable data.
Det finns ett antal sällsynta och följaktligen inte tillräckligt beskrivna bakteriella patogener som rapporteras orsaka allvarliga infektioner, särskilt i patienter med nedsatt immunförsvar. I de flesta fall bara några data, mestadels publicerade som fallrapporter, finns som undersöka vilken roll sådana patogener som ett smittämne. Därför, i syfte att klargöra den patogena karaktären av sådana mikroorganismer, är det nödvändigt att genomföra epidemiologiska studier som omfattar ett stort antal av dessa bakterier. De metoder som används i ett sådant uppföljningsstudie måste uppfylla följande kriterier: identifiering av stammarna måste vara korrekt enligt gällande nomenklatur, bör de vara lätta att hantera (robusthet), ekonomisk i rutindiagnostik och de måste generera jämförbara resultat mellan olika laboratorier. Generellt finns det tre strategier för att identifiera bakteriestammar i en rutin inställning: 1) fenotypisk identifiering karaktäriserar BioChemical och metaboliska egenskaper av bakterierna, 2) molekylära tekniker, såsom 16S rRNA-genen sekvensering och 3) masspektrometri som ett nytt proteom baserad metod. Eftersom masspektrometri och molekylära metoder är de mest lovande verktygen för att identifiera ett stort antal bakteriearter, är dessa två metoder som beskrivs. Förskott, begränsningar och potentiella problem när du använder dessa tekniker diskuteras.
Säker identifiering av sällsynta patogener i rutindiagnostik hämmas av det faktum att klassiska kulturella och biokemiska metoder är besvärliga och ibland tvivelaktig. Vidare har en diagnostisk mikrobiologiska laboratoriet för att bearbeta ett stort antal patogener, som sträcker sig från några hundra till flera tusen, dagligen, vilket kräver användning av automatiserade system. Utöver hanteringen av en hög daglig genomströmning krävs exakt identifiering av bakteriearter. Detta är motiverat eftersom de skiljer sig i sina resistensmönster och därför korrekt identifiering ger läkaren viktig information för att välja lämpliga antibiotika (t.ex. Enterococcus spp., Acinetobacter spp.) 12,43.
Automatiserade mikrobiella identifieringssystem (AMIS) tillämpa standardiserade uppsättningar av enzymatiska reaktioner för att karakterisera de metaboliska egenskaperna hos bakterieisolat <sup> 13,15,16,26,27. Även om patronerna som används i dessa system använder ett stort antal olika biokemiska reaktioner, t.ex., 47 i GN kortet i AMIS användes i denna studie 52, denna strategi tillåter säker identifiering endast för ett begränsat antal bakterier. Vidare är databasen, ett avancerat expertsystem, klart inriktad på detektering av relevanta och högst relevanta bakterier av medicinsk betydelse 13,15,16,36. Ytterligare två system, ofta används i laboratorier, även tillämpa denna biokemiska tillvägagångssätt för bakteriell identifiering. Nyligen genomförda studier visar en jämförbar identifieringsnoggrannhet mellan AMIS användes i denna studie och en av konkurrenterna (93,7% och 93,0% respektive), medan den 3: e Amis har en identifieringsnoggrannhet på endast 82,4% på artnivå 35. Sådana skillnader kan förklaras av kvaliteten på de underliggande identifieringsdatareferenser, versionerna av byggsatser och programvara, skillnader i metabolism och skicklighet av teknisk personal 35,36.
Två automatiska MALDI-TOF MS-system (MALDI-TOF mikrobiell identifieringssystem, MMI) används främst. Dessa system medger detektering av ett stort antal bakteriearter baserat på deras proteinfingeravtrycks masspektra. Exempelvis databasen av de MMI används innehåller 6000 referensspektra. Identifieringssystem baserade på masspektrometri erbjuder snabb och tillförlitlig detektering av en stor mångfald mikroorganismer inklusive sällsynta patogener 11,48,51. Hittills har endast ett fåtal direkta jämförelser finns mellan MMI används i denna studie och dess konkurrent 19,33. Enligt Dæk et al. Båda systemen ger en liknande hög grad av identifiering noggrannhet, men de MMI användes i denna studie verkar vara mer tillförlitliga i artidentifiering 19.
På samma sätt, adresse molekylära tekniker väl bevarade men också distinkta gener ( <em> t ex 16S rDNA eller rpoB) tillåta en tydlig artbestämning 3,22,61. Bland dessa är 16S rDNA den mest använda housekeeping-gen på grund av sin närvaro i alla bakterier 34. Dess funktion är oförändrad och slutligen, med ungefär 1500 bp, det är tillräckligt lång för att vara lämpliga för bioinformatik 14,34. Många forskare anser 16S rRNA genanalys som "guldstandard" för bakteriell identifiering 21. Detta beror på det faktum att få laboratorier använder DNA-DNA hybridiseringstekniker hittills för identifiering av sällsynta eller nya bakterier 14,34. Dessutom, fler och fler databaser finns tillgängliga som kan användas för 16S rRNA genanalys 50. Emellertid måste man ta hänsyn till att 16S rDNA baserade detektionssystem har en begränsad känslighet jämfört med standard-PCR-protokoll. Dessutom är den molekylära tillvägagångssätt sofistikerade, tidskrävande och kräver högt utbildad personal samtdedikerade laboratorier och är därför inte lätt implementeras i rutindiagnostik 55. Dessutom har det visat sig att kombinationen av åtminstone två olika metoder för bakteriell identifiering leder till mycket noggrann stamidentifiering. Kombinationen av MALDI-TOF MS och 16S rDNA-sekvensering möjliggör identifiering av ett stort antal olika bakteriearter med hög noggrannhet. Nyligen kombinationen av MALDI-TOF MS och 16S rRNA genanalys presenterades för bakteriell identifiering studera epidemiologiska frågor och sällsynta patogener 56.
Både MALDI-TOF MS och 16S rRNA gensekvenser erbjuder möjligheten att identifiera ett stort antal olika bakterier. MALDI-TOF MS är en snabb och billig metod, vilken är enkel att hantera och stora databaser av bakteriellt masspektra är tillgängliga. Av denna anledning är MALDI-TOF MS en snabb, kostnadseffektiv och tillförlitlig metod för att genomföra screening studier inriktade på sällsynta bakteriella patogener 17,20,39,51. I en prospektiv studie som jämförde MALDI-TOF MS med andra fenotypiska m…
The authors have nothing to disclose.
The authors would like to thank Prof. Enno Jacobs for his continuing support.
CHROMASOLV, HPLC grade water, 1 L | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | 270733 | |
Tissue Lyser LT | Qiagen, Hilden, Germany | 85600 | Oscillating Homogenizer |
Glass-beads 1,0mm | VWR International, Darmstadt, Germany | 412-2917 | |
Thermomixer 5436 | Eppendorf, Hamburg, Germany | 2050-100-05 | |
QIAamp DNA Mini Kit (250) | Qiagen, Hilden, Germany | 51306 | |
Taq PCR Core Kit (1000 U) | Qiagen, Hilden, Germany | 201225 | |
Forward Primer TPU1 (5´-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’) | biomers.net GmbH, Ulm, Germany | – | |
Reverse Primer RTU4 (5´-TAC CAG GGT ATC TAA TCC TGT T-3´) | biomers.net GmbH, Ulm, Germany | – | |
Mastercycler | Eppendorf, Hamburg, Germany | - | Thermocylcer |
Reaction tube 1.5 mL | SARSTEDT, Nümbrecht, Germany | 72,692 | |
Reaction tube 2 mL | SARSTEDT, Nümbrecht, Germany | 72,693,005 | |
PCR 8er-CapStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 711040X | |
PCR 8er-SoftStrips | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 711030X | |
Sharp R-ZV11 | Sharp Electronics, Hamburg, Germany | – | Microwave |
Titriplex III (EDTA Na2-salt dehydrate; 1 kg) | Merck, Darmstadt, Germany | 1084211000 | |
SeaKem LE Agarose | Biozym Scientific, Hessisch Oldendorf, Germany | 849006 | |
(2 x 500 g) | |||
SmartLadder SF – 100 to 1000 bp | Eurogentec, Lüttich, Belgium | MW-1800-04 | |
Bromphenol blue (25 g) | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | B0126 | |
Xylene cyanol FF (10 g) | Sigma-Aldrich Chemie, München, Germany | X4126 | |
ComPhor L Maxi | Biozym, Hessisch Oldendorf, Germany | – | |
Ethidium bromide solution 1 %(10 mL) | Carl Roth, Karlsruhe, Germany | 2218.1 | |
Gel Doc 2000 | Bio-Rad Laboratories, München, Germany | – | Gel-documentation system |
ExoSAP-IT (500 reactions) | Affymetrix UK, Wooburn Green, High Wycombe, United Kingdom | 78201 | |
Buffer (10 x) with EDTA | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 402824 | |
BigDye Terminator Kit v1.1 | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4337450 | |
Hi-Di formamide (25 mL) | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4311320 | |
DyeEx 2.0 Spin Kit (250) | Qiagen, Hilden, Germany | 63206 | |
3130 Genetic Analyzer | Life Technologies, Darmstadt, Germany | – | Sequenzer |
MicroAmp optical 96-well reaction plate with barcode | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4306737 | |
3130 Genetic Analyzer, plate base 96-well | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4317237 | |
3130 Genetic Analyzer, plate retainer 96-well | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4317241 | |
3130 Genetic Analyzer, well plate septa | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4315933 | |
3130 Genetic Analyzer, POP-7 Polymer, 7 mL | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4352759 | |
3130 Genetic Analyzer, 4-Capillary Array, 50 cm | Life Technologies, Darmstadt, Germany | 4333466 | |
Sequencing Analysis Software 5.4 | Life Technologies, Darmstadt, Germany | – | |
microflex (the MALDI TOF MS maschine) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
MALDI Biotyper (the MALDI TOF MS system) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | our mMIS |
VITEK MS | bioMérieux, Nürtingen, Germany | 2nd mMis | |
flexControl 3.4 (control software) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
Biotyper Realtime Classification 3.1 (RTC), (analysis software) | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | – | |
α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, HCCA, 1 g | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 201344 | |
Peptide Calibration Standard II | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 222570 | |
MSP 96 target polished steel | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | 8224989 | |
peqgreen | peqlab | 37-5010 | |
MALDI Biotyper Galaxy | Bruker Daltonik, Bremen, Germany | Part No. 1836007 | |
Vitek 2 | bioMérieux, Nürtingen, Germany | our aMis | |
MicroScan | Beckman Coulter | 2nd aMis | |
BD Phoenix™ Automated Microbiology System | BD | 3rd aMis | |
Staphylococcus aureus subsp. aureus Rosenbach (ATCC® 25923™) | ATCC | postive control for PCR |