इवांस नीले रंग की डाई के साथ zebrafish लार्वा कंकाल की मांसपेशी वफ़ादारी का विश्लेषण
Summary
In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.
Abstract
The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.
Introduction
Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish neuromuscular रोग 2,29 के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में उभर रहे हैं। तिथि करने के लिए, zebrafish प्रणाली, नया पेशी रोग के कारण म्यूटेशन 16,17,30 मान्य उपन्यास pathomechanisms 18 स्पष्ट है, और संभावित नए चिकित्सीय औषधियों 12,24 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया है। ये सामूहिक प्रयासों मानव neuromuscular रोगों मॉडल करने के लिए zebrafish की उपयोगिता की स्थापना की है। हालांकि, zebrafish और स्तनधारी मॉडल के साथ की गई प्रगति के बावजूद, neuromuscular की स्थिति की व्यापक स्पेक्ट्रम के भीतर रोगियों के लिए सीमित उपचार विकल्प हैं। इसलिए, एक उच्च मांग विनाशकारी रोगों के इस समूह के लिए चिकित्सा के विकास के लिए मौजूद है। चिकित्सा विज्ञान के लिए इस मांग को समानांतर नया पशु मॉडल और ख्यात चिकित्सकीय रणनीति को सत्यापित करने के लिए चल रहे प्रयोगात्मक नवाचार, साथ ही कठोर विश्लेषण के लिए इसी की जरूरत है।
ईबीडी विश्लेषण सामान्यतः करने के लिए माउस मॉडल में इस्तेमाल किया जाता हैअध्ययन के ऊतकों और मस्तिष्क, हृदय में सेलुलर क्षति, और कंकाल की मांसपेशी 27,31। सबसे विशेष रूप से, ईबीडी मांसपेशी झिल्ली अस्थिरता की गंभीरता दिखाने के लिए और 8 को नुकसान करने के लिए विभिन्न पेशी dystrophy उपप्रकार के माउस मॉडल में बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया जाता है। मांसपेशी झिल्ली क्षति प्रकट करने के लिए ईबीडी का उपयोग मानव रोग राज्य से 9 पशु मॉडल की समानता की स्थापना के एक सहायक पैरामीटर है। माउस में ईबीडी की शक्ति को विकसित करने और neuromuscular रोग की zebrafish मॉडल के लिए ईबीडी लागू करने के लिए, हमारे अपने सहित कई प्रयोगशालाओं, प्रेरित किया है। कारण ईबीडी विश्लेषण के लागू करने के लिए, इस तकनीक को सक्रिय रूप से मानव रोग राज्य 11,15,22,24,32 करने के लिए zebrafish मॉडल की पुष्टि करने के लिए लागू किया जा रहा है। क्षतिग्रस्त मांसपेशियों की झिल्ली के साथ लार्वा मांसपेशी फाइबर के भीतर ईबीडी तेज और इसलिए लाल प्रतिदीप्ति होगा। अलग-अलग मांसपेशी फाइबर के भीतर अंतर-फाइबर अंतरिक्ष में मनाया प्रतिदीप्ति, लेकिन नहीं भी टी में तहखाने झिल्ली से detaching फाइबर की जानकारीपूर्ण हो सकता हैउपयोगी नैदानिक विस्तार प्रदान झिल्ली क्षति का वह अनुपस्थिति। ईबीडी विश्लेषण पशु मॉडल सत्यापन के परे संभावित आवेदन किया है। हमारी प्रयोगशाला से प्रयासों हाल ही में ईबीडी विश्लेषण संभावित उपन्यास चिकित्सीय औषधियों 24 को मान्य करने में लाभकारी है कि प्रदर्शन किया है। संभावित चिकित्सीय उपचार को कम करने या प्रासंगिक उपचारात्मक कार्रवाई 8 सूचित कर सकते neuromuscular रोग मॉडल में ईबीडी तेज समाप्त यदि निर्धारण। विश्लेषण के इस प्रकार के चिकित्सा विज्ञान के तंत्र (एस) की स्थापना में मदद मिलेगी और ईबीडी विश्लेषण के आवेदन फैलता जा सकता है।
कई तकनीकों के साथ के रूप में, ईबीडी विश्लेषण प्रयोगात्मक डिजाइन और अभ्यास के दौरान मनाया जा कई निरंतर करता है। उदाहरण के लिए, यह कारण उम्र के साथ ऊतक का उमड़ना को CCV की पहचान करने के लिए चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसके अतिरिक्त, यह प्रायोगिक मायने रखता कम करने और लार्वा की बड़ी संख्या को तैयार करने की जरूरत बढ़ रही है, और इससे पहले कि पेरिकार्डियल इंजेक्शन के दौरान तैयारी में लार्वा क्षति के लिए आसान है।क्षतिग्रस्त मांसपेशियों ईबीडी का समय लग सकता है इसके अलावा, हैंडलिंग और इंजेक्शन के दौरान लार्वा के लिए किया शारीरिक क्षति झूठी सकारात्मक हो सकता है। इन बाधाओं से कुछ दूर करने के लिए, हम इंजेक्शन और पूर्व बाद के विश्लेषण के लिए निम्न तुरंत सफल डाई अर्क के साथ लार्वा के आसान और विश्वसनीय पहचान की अनुमति देता है कि इस वीडियो लेख में एक सह इंजेक्शन रणनीति का वर्णन किया है। प्रायर मांसपेशी फाइबर द्वारा अपने तेज करने के लिए वाहिका में ईबीडी की पुष्टि की अनुमति देकर सफल इंजेक्शन के लिए सह इंजेक्शन नियंत्रण FITC-dextran। ईबीडी प्रतिदीप्ति मांसपेशी फाइबर में एकत्र नहीं करता है, तो कई घंटे के बाद लार्वा में अत्यधिक फैलाना हो जाता है के रूप में यह विशेष रूप से उपयोगी हो सकता है; जैसे, यह पता लगाने के लिए मुश्किल हो सकता है। इसके अलावा, CCV लापता और जर्दी या शरीर गुहा में ईबीडी इंजेक्शन लगाने, ऊष्मायन के बाद, क्षतिग्रस्त मांसपेशी फाइबर से तेज की कम संभावना के साथ अभी तक, भ्रूण को नियंत्रित करने के लिए इसी तरह फैलाना लाल प्रतिदीप्ति में परिणाम कर सकते हैं। सामूहिक रूप से, इन गुफाएटीएस ईबीडी इंजेक्शन सुसंगत और विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए धैर्य और अभ्यास की आवश्यकता है सुझाव देते हैं।
सभी में, हम zebrafish लार्वा पर ईबीडी विश्लेषण करने के लिए एक व्यावहारिक और सरल विधि का वर्णन है। तिथि करने के लिए, एक मॉडल प्रणाली के रूप में zebrafish के उपयोग, विशेष रूप से एक मानव रोग मॉडल के रूप में तेजी से विस्तार किया गया है। इस विस्तार के लिए zebrafish प्रणाली की वर्तमान फायदे पर सुधार कि प्रयोगात्मक तकनीक के निरंतर विकास और संशोधन करने के लिए आंशिक रूप से की वजह से है। ईबीडी इंजेक्शन तकनीक का सत्यापन और zebrafish पेशी रोग मॉडल के अध्ययन के लिए एक शोधकर्ता के शस्त्रागार के लिए एक अतिरिक्त और शक्तिशाली उपकरण प्रदान करता है। इस तकनीक के चल रहे कार्यान्वयन और संशोधन के उपन्यास चिकित्सीय रणनीतियों के साथ ही बीमारी के कारण तंत्र को उजागर करने में मदद करने की क्षमता है।
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपने तकनीकी सहायता के लिए ट्रेंट वॉ का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। हम यह भी बीमार बच्चों और इस परियोजना के लिए उनकी उदार आर्थिक सहायता के लिए इलाज जन्मजात पेशी अपविकास (सीएमडी) के लिए अस्पताल में बाल रोग विभाग को स्वीकार करते हैं।
Materials
| Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
| 100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
| Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
| Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
| Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |
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