Evans Blue Dye ile Zebra balığı Larva İskelet Kası Bütünlüğü Analizi
Summary
In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.
Abstract
The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.
Introduction
Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebra balığı nöromüsküler hastalık 2,29 çalışma için güçlü bir araç olarak ortaya çıkmaktadır. Bugüne kadar, zebra balığı sistemi, yeni kas hastalığa neden olan mutasyonlar 16,17,30 doğrulamak yeni patolojik mekanizmalar 18 aydınlatmak ve potansiyel yeni tedavi edici ilaçlar 12,24 tanımlamak için kullanılmıştır. Bu kolektif çabalar, insan nöromüsküler hastalıkları modellemek için Zebra balığı yararını kurduk. Ancak, zebra balığı ve memeli modelleri ile yapılan ilerlemelere rağmen, nöromüsküler koşulları geniş spektrumu içinde hastalar için sınırlı tedavi seçenekleri vardır. Bu nedenle, yüksek bir talep yıkıcı hastalıkların bu grup için tedavi geliştirilmesine ihtiyaç vardır. Tedavi için bu talebi paralel yeni hayvan modelleri ve varsayılan tedavi stratejileri doğrulamak için sürekli deneysel yenilik yanı sıra titiz analiz için gelen bir ihtiyaçtır.
EBD analizi yaygın fare modellerinde kullanılanÇalışma dokusu ve beyin, kalp hücresel hasar ve iskelet kası 27,31. En önemlisi, EBD kas zarı istikrarsızlık şiddetini göstermek ve 8 zarar çeşitli kas distrofi alt tiplerinin fare modellerinde yaygın olarak kullanılır. Kas zarı hasarı ortaya çıkarmak için EBD kullanımı, insan hastalık durumuna 9 hayvan modelinin benzerlik kuran destekleyici bir parametredir. Fare EBD güç geliştirmek ve nöromüsküler hastalık zebrabalıkları modellere EBD uygulamak, kendi dahil olmak üzere birçok laboratuarları, yol açmıştır. Nedeniyle EBD analizinin uygulanabilirliği, bu tekniğin etkin insan hastalık durumuna 11,15,22,24,32 için Zebra balığı modellerini doğrulayacak uygulanmaktadır. Hasarlı kas zarlarla Larva kas lifleri içinde EBD alımı ve dolayısıyla kırmızı floresan sahip olacaktır. Tek kas lifleri içindeki ara-lif alan gözlenen floresans değil, aynı zamanda, t bazal membran ayırma liflerin bilgi verici olabiliryararlı tanı detay sağlayan membran hasar o yokluğu. EBD analizi hayvan modeli doğrulama ötesinde potansiyel uygulama vardır. Bizim laboratuarından çabalar son zamanlarda EBD analizi potansiyel yeni tedavi ilaçları 24 doğrulayarak yararlı olduğunu göstermiştir. Potansiyel tedavi tedaviler azaltmak veya ilgili terapötik eylem 8 delalet edebilir nöromusküler hastalık modellerinde EBD alımını kaldırılması durumunda belirleme. Bu tip analiz terapötik mekanizması (ler) kurmaya yardımcı ve EBD analizi uygulaması genişletir olabilir.
Birçok teknikleri ile olduğu gibi, EBD analizi deneysel tasarım ve uygulama sırasında dikkat edilmesi gereken birkaç uyarılar var. Örneğin, nedeniyle yaş doku kalınlaşması ccv belirlemek zor olabilir. Buna ek olarak, bu deney sayısını azaltmak ve larvaların sayıda hazırlık için ihtiyaç artmaktadır önce ve perikardiyal enjeksiyon sırasında hazırlanmasında larvalarına kolaydır.Hasarlı kas EBD sürebilir Dahası, taşıma ve enjeksiyon sırasında larva yapılan fiziksel hasar yanlış pozitif sonuç verebilir. Bu engellerin bazılarının üstesinden gelmek için, biz enjeksiyon ve önceki sonraki analiz için aşağıdaki derhal başarılı boya infüzyonu ile larva kolay ve güvenilir şekilde belirlenmesini sağlar, bu video makalede bir ko-enjeksiyon stratejisi nitelendirdiler. Önce kas lifleri tarafından alımına vaskülatürde EBD onayını vererek başarılı enjeksiyon için ko-enjeksiyon kontrolleri FITC-dekstran. EBV floresans kas lifleri toplanan takdirde birkaç saat sonra larva oldukça yaygın hale gelir, bu durum özellikle faydalı olabilir; gibi, bu tespit etmek zor olabilir. Buna ek olarak, CCV eksik ve yumurta sarısı veya vücut boşluğu içine enjekte EBD, inkübasyondan sonra, hasarlı kas lifleri tarafından alım olasılığının azaltılması ile, henüz kontrol embriyolarına benzer bir difüz-kırmızı flüoresans neden olabilir. Topluca, bu mağaraats EBD enjeksiyon, tutarlı ve güvenilir sonuçlar elde etmek için sabır ve pratik gerektirir öneririz.
Toplamda, biz Zebra balığı larvaları üzerinde EBD analizi gerçekleştirmek için pratik ve basit bir yöntem açıklanmaktadır. Bugüne kadar, bir model sistem olarak zebrabalıkları kullanımı, özellikle de bir insan hastalığı modeli olarak, hızlı bir şekilde genişlemektedir. Bu genişleme zebrabalıkları sisteminin mevcut avantajları üzerine geliştirmek deneysel tekniklerin sürekli gelişme ve değişiklik kısmen kaynaklanmaktadır. EBD enjeksiyon tekniği doğrulama ve Zebra balığı kas hastalığı modellerinin çalışma için bir araştırmacının cephanelik ek ve güçlü bir araç sağlar. Bu tekniğin devam eden uygulama ve modifikasyon yeni tedavi stratejilerinin yanı sıra hastalığa neden olan mekanizmaları açığa çıkarmalarına yardımcı potansiyeline sahiptir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz onun teknik yardım için Trent Waugh teşekkür etmek istiyorum. Biz de Hasta Çocuk ve bu proje için onların cömert finansmanı için Cure Konjenital Musküler Distrofi (CMD) için Hastanesi Pediatri Bölümü kabul etmiş sayılırsınız.
Materials
| Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
| 100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
| Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
| Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
| Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |
References
- Verma, S., Anziska, Y., Cracco, J. Review of Duchenne muscular dystrophy (DMD) for the pediatricians in the community. Clin Pediatr (Phila. 49, 1011-1017 (2010).
- Gibbs, E. M., Horstick, E. J., Dowling, J. J. Swimming into prominence: the zebrafish as a valuable tool for studying human myopathies and muscular dystrophies). FEBS J. 280, 4187-4197 (2013).
- Lancet, . , 381-845 (2013).
- Lapidos, K. A., Kakkar, R., McNally, E. M. The dystrophin glycoprotein complex: signaling strength and integrity for the sarcolemma. Circ Res. 94, 1023-1031 (2004).
- Campbell, K. P., Kahl, S. D. Association of dystrophin and an integral membrane glycoprotein. Nature. 338, 259-262 (1989).
- Cohn, R. D., Campbell, K. P. Molecular basis of muscular dystrophies. Muscle Nerve. 23, 1456-1471 (2000).
- Yoshida, M., Ozawa, E. Glycoprotein complex anchoring dystrophin to sarcolemma. J Biochem. 108, 748-752 (1990).
- Straub, V., Rafael, J. A., Chamberlain, J. S., Campbell, K. P. Animal models for muscular dystrophy show different patterns of sarcolemmal disruption. J Cell Biol. 139, 375-385 (1997).
- Matsuda, R., Nishikawa, A., Tanaka, H. Visualization of dystrophic muscle fibers in mdx mouse by vital staining with Evans blue: evidence of apoptosis in dystrophin-deficient muscle. J Biochem. 118, 959-964 (1995).
- Bassett, D., Currie, P. D. Identification of a zebrafish model of muscular dystrophy. Clin Exp Pharmacol Physiol. 31, 537-540 (2004).
- Gupta, V., et al. The zebrafish dag1 mutant: a novel genetic model for dystroglycanopathies. Hum Mol Genet. 20, 1712-1725 (2011).
- Kawahara, G., et al. Drug screening in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 5331-5336 (2011).
- Guyon, J. R., et al. Modeling human muscle disease in zebrafish. Biochim Biophys Acta. 1772, 205-215 (2007).
- Cavanna, J. S., et al. Molecular and genetic mapping of the mouse mdx locus. Genomics. 3, 337-341 (1988).
- Bassett, D. I., et al. Dystrophin is required for the formation of stable muscle attachments in the zebrafish embryo. Development. 130, 5851-5860 (2003).
- Horstick, E. J., et al. Stac3 is a component of the excitation-contraction coupling machinery and mutated in Native American myopathy. Nat Commun. 4, (1952).
- Davidson, A. E., et al. Novel deletion of lysine 7 expands the clinical, histopathological and genetic spectrum of TPM2-related myopathies. Brain. 136, 508-521 (2013).
- Telfer, W. R., Nelson, D. D., Waugh, T., Brooks, S. V., Dowling, J. J. Neb: a zebrafish model of nemaline myopathy due to nebulin mutation. Dis Model Mech. 5, 389-396 (2012).
- Dowling, J. J., et al. Oxidative stress and successful antioxidant treatment in models of RYR1-related myopathy. Brain. 135, 1115-1127 (2012).
- Detrich, H. W., Westerfield 3rd, ., M, L. I., Zon, . Overview of the Zebrafish system. Methods Cell Biol. 59, 3-10 (1999).
- Whitfield, T. T., et al. Mutations affecting development of the zebrafish inner ear and lateral. , 123-241 (1996).
- Kawahara, G., Guyon, J. R., Nakamura, Y., Kunkel, L. M. Zebrafish models for human FKRP muscular dystrophies. Hum Mol Genet. 19, 623-633 (2010).
- Baraban, S. C., Dinday, M. T., Hortopan, G. A. Drug screening in Scn1a zebrafish mutant identifies clemizole as a potential Dravet syndrome treatment. Nat Commun. 4, (2013).
- Waugh, T. A., et al. Fluoxetine prevents dystrophic changes in a zebrafish model of Duchenne muscular dystrophy. Hum Mol Genet. 23 (17), 4651-4662 .
- Horstick, E. J., Gibbs, E. M., Li, X., Davidson, A. E., Dowling, J. J. Analysis of embryonic and larval zebrafish skeletal myofibers from dissociated preparations. J Vis Exp. 50259, (2013).
- Smith, L. L., Beggs, A. H., Gupta, V. A. Analysis of skeletal muscle defects in larval zebrafish by birefringence and touch-evoke escape response assays. J Vis Exp. 50925, (2013).
- Hamer, P. W., McGeachie, J. M., Davies, M. J., Grounds, M. D. Evans Blue Dye as an in vivo. marker of myofibre damage: optimising parameters for detecting initial myofibre membrane permeability. J Anat. 200, 69-79 (2002).
- Guyon, J. R., et al. Genetic isolation and characterization of a splicing mutant of zebrafish dystrophin. Hum Mol Genet. 18, 202-211 (2009).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. J Clin Invest. 122, 2337-2343 (2012).
- Majczenko, K., et al. Dominant Mutation of CCDC78 in a Unique Congenital Myopathy with Prominent Internal Nuclei and Atypical Cores. Am J Hum. , (2012).
- Wooddell, C. I., et al. Use of Evans blue dye to compare limb muscles in exercised young and old mdx mice. Muscle Nerve. 41, 487-499 (2010).
- Hall, T. E., et al. The zebrafish candyfloss mutant implicates extracellular matrix adhesion failure in laminin alpha2-deficient congenital muscular dystrophy. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 7092-7097 (2007).
