Protocol
1. Preparação de Agar placas de injeção (Tempo: 45 min)
- Ferver 2% a 3% de agarose em meio E3 e permita que a solução arrefecer ligeiramente no banco. Nota: O número de placas de injecção a ser preparado dita a quantidade de agarose necessária. Cada placa de injecção necessita de cerca de 35 ml da solução de agarose.
- Depois de ferver, permitir que a agarose a arrefecer até a temperatura desejada seja atingida (por exemplo., 45 ° C) de acordo com as instruções do fabricante do molde de injecção.
- Pour cerca de 35 ml de agarose a arrefecido em um prato de 100 mm.
- Coloque uma extremidade do molde de injeção preferido na solução, em seguida, estabelecer restante do molde sobre solução de agarose (isso vai ajudar a reduzir a ocorrência de bolhas de ar).
- Permitir que a solução de agarose para solidificar quer à TA ou a 4 ° C durante aproximadamente 30 min.
- Usar uma espátula para separar uma extremidade do molde a partir da agarose sólida. Lentamente remover o restante do m velho.
2. Preparação de Evans Blue Dye (EBD) Injeção Mix (Tempo: 30 min)
- Adicione um estoque de 1% de CAE em solução de 1X Ringer (NaCl 155; KCl 5 mM; CaCl2 2 mM; MgCl2 1 mM; 2 mM de Na 2 HPO 4; HEPES 10 mM; glucose 10 mM; pH a 7,2), que pode ser armazenado à temperatura ambiente.
- Adicione uma solução de reserva de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -dextrano MW 10.000 kDa a 25 mg / ml em solução e armazenamento de 1X Ringer a -20 ° C.
- Preparar a mistura de injecção através da diluição para 0,1% CAE directamente na solução estoque de estoque de FITC-dextrano (isto é, para um volume de trabalho de 100 uL finais:. Misturar 10 ul de 1% CAE em 90 ul de estoque de dextrano FITC).
- Misture bem injeção vórtice (que deve ficar verde) e manter fora da luz direta envolvendo injeção de tubo de mistura em papel alumínio.
3. Preparação Injeção EBD (Tempo: Cerca de 30 min)
ent "> Nota: protocolo funciona melhor com larvas de 3-7 dias após a fertilização (DPF).- Placa de injecção pré-aquecer a RT.
- Configure aparelho de injecção, organizando micromanipulador na placa de metal e ficar ao lado do microscópio que está sendo usado para a injeção. Ligue controlador de microinjeção ar conduzido. Nota: O sistema de injeção preferido irá variar em laboratório e não deve alterar resultado da análise.
- Voltar encher agulha de injecção com cerca de 2-4 ul da mistura EBD.
- Calibrar volume de injeção de cerca de 5 nl de mix EBD. Nota: Injecção de calibragem de volume dependerá método de calibração. Uma injecção de êmbolo accionado directamente pode ser definido para um determinado volume de injecção ao passo que os injectores de gás de pressão terá o volume de injecção de bolus por via do volume calibrado com a utilização de um micrómetro.
- Placa de injecção molhada com solução de Ringer 1X e remover o excesso de poços.
- Larvas pré-prazer, com 0,04% de acetato de 3-aminobenzoato de sal metanossulfonatot (tricaina) diluídos em solução de Ringer 1X para imobilizar larvas antes do início da injecção. Nota: Garantir larvas são completamente immotile é importante como uma injecção adequada é difícil com qualquer movimento residual.
- Coloque larvas anestesiados nos poços das placas de agar utilizando injecção de uma pipeta de vidro. Certifique-se de que as larvas são completamente dentro do poço e deitado sobre seu lado. Nota: O número de larvas por poço é até o experimentador.
- Depois de larvas são colocadas nas cavidades, remover excesso de solução de Ringer para minimizar o movimento larvas dentro do poço. Deixar uma quantidade residual de solução para que as larvas não desidratar.
4. Injeção Pericárdica de Zebrafish larvas com EBD (Tempo: Dependente do número de larvas de injecção, estima 1-3 hr)
- Colocar a placa de injecção contendo as larvas em um escopo de dissecação onde as injecções serão realizados.
- Posicione a agulha pipeta de injeção contendoCAE misturar mais de um larvas do peixe.
- Reposicionar a placa de injecção através da rotação de modo que a agulha de injecção está próximo do coração do larvas e cerca de 45 ° ventralmente em relação ao eixo ântero-posterior.
- Inserir a agulha de injecção na veia cardinal comum (CCV) na região da veia na porção anterior da gema quando a veia está inicialmente rodar na direcção dorsal (Figura 1). Nota: A ampliação de até 40x pode ser útil para ver claramente o CCV.
- Injectar 5 nl de mix EBD e manter agulha de injeção na posição para 5-8 segundos para minimizar a perda imediata do mix EBD. Nota: Uma boa injecção terá corante coloração visto nas câmaras do coração (Figura 1). Se EBD mistura não é observada no coração e, em seguida injectando um adicional de 5 nl mistura EBD pode ser suficiente para induzir a absorção do corante. Alternativamente, o embrião pode ser descartado.
Nota: Em algumas situações, o coração pode parar de bater. Se este óccurs, continuar a acompanhar as larvas de 20-40 seg. Tipicamente, o coração recomeça a bater como o corante se move através do sistema circulatório. - Passar para a próxima larvas e repita.
- Identificar embriões injectados com sucesso mediante a observação da presença de FITC-dextrano na vasculatura imediatamente após a injecção (Figura 2).
5. Incubação e EBD Captação (Tempo: 4-6 hr)
- Após o número desejado de larvas são injectados, larvas injectadas retorno para a solução de Ringer 1X sem tricaina em placas de 100 mm.
- Mantenha pratos embrulhados em papel alumínio. Nota: Manter larvas injetadas no escuro aumenta significativamente as taxas de sobrevivência e garante a maior consistência na intensidade do sinal. Embalagem em folha de alumínio é especialmente importante durante o período de tempo que as larvas estão fora da incubadora.
- Permitir que as larvas incubar a 28,5 ° C durante 4-6 horas para assegurar a aceitação EBD suficiente. 6. Visualização da EBD no músculo (Tempo: Dependente do número de larvas e de injecção tipo de microscopia, estimados 0,5-3 hr)
- Antes de imagiologia, anestesiar as larvas com 0,04% tricaina para impedir o movimento.
- Ver larvas sob fluorescência vermelha para determinar se está a ocorrer EBD captação no músculo esquelético (Figura 3).
Representative Results
A mistura de injecção EBD foi injectada na CCV de mutantes homozigóticos sapje e irmãos de tipo selvagem no 3 dpf. As injecções que encheu as câmaras do coração (Figura 1B) foram então analisadas por injecção bem sucedida por meio da visualização de FITC-dextrano na vasculatura sob fluorescência verde (Figura 2).
Após um período de incubação de 4 h, EBD absorção foi examinada a nível somito utilizando microscopia de fluorescência. Irmãos de tipo selvagem exibiram nenhuma fluorescência EBD dentro de quaisquer fibras musculares visíveis (Figura 3A), ao passo que os mutantes homozigóticos sapje EBD mostrou absorção, indicando os danos para a membrana muscular 15 (Figura 3B).
Figura 1. Injectar EBD mix injeção na veia cardinal comum (CCV) de um peixe-zebra embryo. Embrião (A) não injectado. Seta indica a localização ideal para a injeção CCV. (B) injecção bem sucedido para a CCV. O corante entra nas câmaras do coração (seta) e começa a ser bombeado através da vasculatura. (C) Uma injeção vencida CCV irá resultar em alguns ou todos do corante entrar no saco vitelino do embrião (seta). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Os embriões podem ser classificadas para injeção de sucesso, observando distribuição FITC-dextrano sob fluorescência verde em toda a vasculatura imediatamente a seguir à injecção e antes da EBD captação.Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: EBD será retomada por fibras com membranas danificadas irmãos (A) do tipo selvagem mostrando ausência de fluorescência EBD nas fibras musculares.. (B) Sapje mutante homozigótica com fluorescência EBD dentro múltiplas fibras musculares (setas). Todas as larvas foram injectados com a mistura de injecção CAE e analisados após um período de incubação de 4 horas a 3 dpf. Irmãos e mutantes foram ordenados por fibra muscular destacamento antes da injeção CCV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Discussion
Zebrafish estão emergindo como uma poderosa ferramenta para o estudo de 2,29 doença neuromuscular. Até à data, o sistema de peixe-zebra foi utilizado para validar causadores de doenças musculares nova mutações 16,17,30, elucidar novos patomecanismos 18, e potencialmente identificar novas drogas terapêuticas 12,24. Estes esforços coletivos estabeleceram a utilidade do peixe-zebra para modelar doenças neuromusculares humanas. No entanto, apesar dos avanços feitos com modelos de peixe-zebra e mamíferos, há opções limitadas de tratamento para pacientes dentro do amplo espectro de condições neuromusculares. Portanto, existe uma grande demanda para o desenvolvimento de terapia para esse grupo de doenças devastadoras. Em paralelo a essa demanda por terapêutica é a correspondente necessidade de inovação experimental em curso, bem como uma análise rigorosa para verificar novos modelos animais e estratégias terapêuticas putativos.
Análise EBD é comumente usado em modelos de ratos paratecido estudo e danos celulares no cérebro, coração, músculo esquelético e 27,31. Mais notavelmente, EBD é amplamente utilizado em modelos de ratos com vários subtipos de distrofia muscular para mostrar a gravidade da membrana muscular instabilidade e danificar 8. O uso de CAE para revelar danos membrana muscular é um parâmetro de suporte que estabelece semelhanças entre o modelo animal para o estado de doença humana 9. O poder da EBD no rato levou vários laboratórios, inclusive o nosso, para desenvolver e aplicar EBD para modelos de peixe-zebra de doença neuromuscular. Devido à aplicabilidade da análise EBD, esta técnica está ativamente sendo implementadas para corroborar os modelos de peixe-zebra para o estado de doença humana 11,15,22,24,32. Larvas com as membranas musculares danificadas terá captação EBD e fluorescência vermelha, portanto, dentro de fibras musculares. A fluorescência observada no espaço entre as fibras, mas não nas fibras musculares individuais podem também ser informativo de fibras destacados do porão em t membranaele ausência de dano à membrana, fornecendo detalhes úteis de diagnóstico. Análise EBD tem potencial de aplicação para além validação do modelo animal. Os esforços do nosso laboratório demonstraram recentemente que a análise EBD é benéfica na validação de medicamentos terapêuticos potencialmente novos 24. Determinar se os potenciais tratamentos terapêuticos reduzir ou abolir a captação EBD em modelos de doenças neuromusculares podem significar ação terapêutica relevante 8. Este tipo de análise pode ajudar a estabelecer o mecanismo (s) de terapêuticas e expande a aplicação da análise EBD.
Tal como acontece com muitas técnicas, análise EBD tem muitos cuidados a serem observados durante a concepção e prática experimental. Por exemplo, pode ser um desafio para identificar o CCV devido ao espessamento do tecido com a idade. Além disso, é fácil de danificar larvas em preparação antes e durante a injecção do pericárdio, reduzindo a contagem experimentais e aumentando a necessidade de preparar um grande número de larvas.Além disso, os danos físicos causados ao larvas durante o manuseio e de injecção pode resultar em falsos positivos como músculo danificado pode levar até EBD. A fim de ultrapassar alguns destes obstáculos, descrevemos uma estratégia de co-injecção neste artigo de vídeo que permite a identificação fácil e fiável das larvas com infusão de corante sucesso imediatamente após a injecção e antes da análise subsequente. O FITC-dextrano controlos co-injecção para a injecção bem sucedido, permitindo a confirmação de CAE na vasculatura antes da sua absorção pelas fibras musculares. Isto pode ser particularmente útil como EBD fluorescência torna-se altamente difusa em larvas após várias horas, se não recolhidos nas fibras musculares; como tal, pode ser difícil de detectar. Além disso, a falta de CCV e injectando EBD na gema ou cavidade corporal pode, após a incubação, resultam em fluorescência vermelha difusa semelhante para controlar embriões, ainda com a probabilidade reduzida de absorção pelas fibras musculares danificadas. Coletivamente, estas cavernaats sugerem injeção EBD requer paciência e prática para alcançar resultados consistentes e confiáveis.
Ao todo, nós descrevemos um método prático e simples para realizar a análise EBD em larvas do peixe. Até à data, a utilização de peixe-zebra como um sistema modelo, especialmente como um modelo da doença humana, tem vindo a expandir-se rapidamente. Esta expansão é parcialmente devido ao contínuo desenvolvimento e modificação de técnicas experimentais que melhoram sobre as vantagens atuais do sistema peixe-zebra. A técnica de injeção EBD fornece uma ferramenta adicional e poderosa para arsenal do pesquisador para a validação e estudo de modelos de doenças músculo de peixe-zebra. A implementação em curso e modificação desta técnica tem o potencial de ajudar a descobrir novas estratégias terapêuticas, bem como mecanismos que causam doenças.
Disclosures
Os autores não têm concorrentes interesses financeiros ou outros conflitos de interesse.
Acknowledgments
Queremos agradecer Trent Waugh para a sua assistência técnica. Reconhecemos também o Departamento de Pediatria do Hospital for Sick Children e cura da distrofia muscular congênita (DMC) para seu financiamento generoso para este projeto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
| Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
| 100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
| Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
| Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
| Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
| Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
| Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
| Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
| Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
| HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
| Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
| Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |
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