Analys av Zebrafish Larver skelettmuskulatur Integrity med Evans Blue Dye

Summary

In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.

Abstract

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.

Introduction

Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features^1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality^1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane^4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy⁷. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity^8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems^2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.

To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases². To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations^16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms^17,18, and identify novel therapeutic strategies^12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers²⁰. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens²¹, a valuable method for the identification of novel therapeutics^22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation²⁵ and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence²⁶, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.

We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence²⁷. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases^8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje^15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.

Protocol

1. Framställning av Agar Injektions Plates (Tid: 45 min) Koka 2% till 3% agaros i E3 media och låt lösningen svalna något på bänken. Obs: Antalet insprutningsplattor förbereds dikterar mängden agaros krävs. Varje injektion plattan behöver ca 35 ml av agaroslösningen. Efter kokning, tillåta agarosen svalna tills önskad temperatur uppnåtts (t.ex.., 45 ° C) såsom per sprutformen tillverkarens instruktioner. Häll ca 35 ml av den kylda agarosen in i en 100 mm skål. Placera ena änden av föredragna injektion mögel i lösning, sedan lägga resten av mögel på agaroslösning (detta kommer att bidra till att minska förekomsten av luftbubblor). Låt agaroslösningen stelna antingen vid RT eller 4 ° C i ungefär 30 minuter. Använd en spatel för att separera en ände av formen från den fasta agarosen. Sakta ut resten av m gammal. 2. Framställning av Evans Blue Dye (EBD) Injektion Blanda (Tid: 30 min) Gör en 1% stam av EBD i 1X Ringers lösning (155 mM NaCl; 5 mM KCl; 2 mM CaCl2; 1 mM MgCl2; 2 mM Na 2 HPO 4; 10 mM HEPES; 10 mM glukos; pH till 7,2), som kan lagras vid RT. Gör en stamlösning av fluoresceinisotiocyanat (FITC) -dextran MW 10 tusen kDa vid 25 mg / ml i 1X Ringers lösning och förvara vid -20 ° C. Förbered injektion mix genom att späda EBD till 0,1% direkt i stamlösning av FITC-dextran lager (dvs. för en slutlig arbetsvolym av 100 ul. Blanda 10 il 1% EBD på 90 il FITC dextran lager). Grundligt virvel injektion mix (det ska bli grön) och hålla sig borta från direkt ljus genom att linda injektion mix rör i aluminiumfolie. 3. EBD injektionsberedning (Tid: Cirka 30 min) ent "> Obs: Protokoll fungerar bäst med larver från 3-7 dagar efter befruktningen (DPF). Pre-varm injektion plattan RT. Ställ in injektionsapparaten genom att arrangera mikromanipulator på plåt och stå bredvid mikroskopet används för injektion. Slå på luftdriven mikroinjektion controller. Obs: Det föredragna insprutningssystemet varierar beroende på labbet och bör inte ändra resultatet av analysen. Tillbaka fylla injektionsnålen med cirka 2-4 il EBD mix. Kalibrera injektionsvolymen till cirka 5 nl av EBD mix. Obs: Injektionsvolym kalibrering beror på kalibreringsmetod. En kolv driven injektion direkt kan sättas till ett givet injektionsvolym medan gastrycks injektorer behöver injektionsvolymen kalibreras via volym bolus med användning av en mikrometer. Våt injektion tallrik med 1X Ringers lösning och avlägsna överskott från brunnar. Pre-treat larver med 0,04% etyl-3-aminobensoat metansulfonat salt (tricaine) utspädd i 1 x Ringers lösning för att immobilisera larver före starten av injektionen. Obs: Se till larver är helt orörliga är viktigt eftersom ordentlig injektion är svårt med eventuell kvarvarande rörelse. Placera bedövade larver i brunnar i agar injektionsplåtarna med en glaspipett. Se till att larverna är helt inuti brunnen och ligger på sin sida. Obs: Antalet larver per brunn är upp till försöksledaren. Efter larver placeras i brunnarna, avlägsna överskott Ringers lösning för att minimera larver rörlighet inom väl. Lämna en restmängd av lösning så att larverna inte torka. 4. Perikardiell Injektion av Zebrafish Larver med EBD (Tid: Beroende på antal larver injicering, uppskattningsvis 1-3 timmar) Placera injektions skylt som innehåller larver på en dissekera omfattning där injektionerna kommer att utföras. Placera injektionspipetten nålen innehållandeEBD blanda över en zebrafisk larver. Re-positionen insprutningsplattan genom att vrida den så att injektionsnålen är nära larver hjärta och ungefär 45 ° ventralt från den främre-bakre axeln. För in injektionsnålen i den gemensamma kardinal ven (CCV) i området av venen vid den främre delen av äggulan där venen initialt vrida i dorsal riktning (figur 1). Obs: En förstoring på upp till 40x kan vara bra att tydligt se CCV. Injicera 5 nl av EBD mix och hålla injektionsnålen i läge för 5-8 sekunder för att minimera omedelbara läckage av EBD mix. Obs: En bra injektion kommer att ha färg färgning ses i hjärtats kammare (Figur 1). Om EBD mix inte observeras i hjärtat, sedan injicera ytterligare 5 nl av EBD mix kan vara tillräcklig för att framkalla färgupptagning. Alternativt kan embryot kasseras. Obs! I vissa situationer kan hjärtat slutar slå. Om denna Occurs, fortsätta att övervaka larverna för 20-40 sekunder. Typiskt återupptar hjärta slå när färgämnet rör sig genom cirkulationssystemet. Flytta till nästa larver och upprepa. Identifiera framgångsrikt injicerade embryon genom att observera närvaron av FITC-dextran i vaskulaturen omedelbart efter injektion (fig 2). 5. Inkubering och EBD Upptag (Tid: 4-6 timmar) Efter det önskade antalet larver injiceras, retur injicerade larver till 1X Ringers lösning utan tricaine i 100 mm skålar. Håll rätter inslagna i aluminiumfolie. Obs: Att hålla injiceras larver i mörker ökar kraftigt överlevnad och säkerställer den största konsekvensen i signalstyrka. Omslags i aluminiumfolie är särskilt viktigt för den tidsperiod som larverna är utanför inkubatorn. Låt larver inkubera vid 28,5 ° C under 4-6 timmar för att säkerställa tillräcklig EBD upptag. </ol> 6. Visualisering av EBD i Muscle (Tid: Beroende på antal larver injicering och typ av mikroskopi, beräknade 0,5-3 timmar) Före avbildning, bedöva larverna med 0,04% tricaine att förhindra rörelse. Se larver under rött fluorescens för att bestämma om EBD upptag sker i skelettmuskulaturen (Figur 3).

Representative Results

EBD injektionsblandningen injicerades i CCV av sapje homozygota mutanter och vildtyp syskon vid 3 dpf. Injektioner som fyllde hjärtkamrama (Figur 1B) analyserades sedan för lyckad injektion genom att visualisera FITC-dextran i vaskulaturen under grönt fluorescens (figur 2). Efter en fyra timmars inkubation period var EBD upptag undersöktes på somit nivå med hjälp av fluorescensmikroskopi. Vildtyp syskon uppvisade ingen EBD fluorescens inom några synliga muskelfibrer (Figur 3A), medan de sapje homozygota mutanter visade EBD upptag, vilket indikerar skada på muskelmembran 15 (figur 3B). Figur 1. Injicera EBD insprutningsblandningen i gemensamma kardinal ven (CCV) hos en zebrafisk embryo. (A) icke-injicerade embryot. Arrow betecknar idealisk plats för CCV injektion. (B) Framgångsrik injektion i CCV. Färgämnet går in i hjärtats kammare (pil) och börjar att pumpas genom vaskulaturen. (C) En misslyckad CCV injektion kommer att resultera i några eller alla av färgämnet in gulesäcken av embryot (pilen). Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 2. Embryon kan sorteras för lyckad injektion genom att observera FITC-dextran distribution under grön fluorescens hela kärl omedelbart efter injektionen och före EBD upptag.Klicka här för att se en större version av denna siffra. Figur 3: EBD kommer att tas upp av fibrer med skadade membran (A) vildtyp syskon visar ingen EBD fluorescens i muskelfibrerna.. (B) Sapje ​​homozygot mutant med EBD fluorescens inom flera muskelfibrer (pilar). Alla larver injicerades med EBD injektionsblandningen och analyserades efter en 4 h inkubationsperiod vid 3 DPF. Syskon och mutanter sorterade muskelfibrer lossnar före CCV injektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Zebrafisk växer fram som ett kraftfullt verktyg för att studera neuromuskulär sjukdom ^2,29. Hittills har zebrafisk systemet använts för att validera nya muskel sjukdomsalstrande mutationer ^16,17,30, belysa nya pathomechanisms ^18, och identifiera potentiella nya terapeutiska läkemedel ^12,24. Dessa kollektiva ansträngningar har etablerat nyttan av zebrafisk att modellera mänskliga neuromuskulära sjukdomar. Trots de framsteg som gjorts med zebrafisk och däggdjurs modeller, det finns begränsade behandlingsalternativ för patienter inom brett spektrum av neuromuskulära förhållanden. Därför finns en stor efterfrågan för terapi utveckling för denna grupp av förödande sjukdomar. Parallellt denna efterfrågan på läkemedel är motsvarande behovet av pågående experimentella innovation, samt en noggrann analys för att verifiera nya djurmodeller och förmodade terapeutiska strategier.

EBD-analys används ofta i musmodeller förstudie vävnad och cellskador i hjärnan, hjärtat och skelettmuskulaturen ^27,31. Framför allt är EBD används flitigt i musmodeller av olika muskeldystrofi subtyper att visa allvaret i muskelmembran instabilitet och skada ^8. Användningen av EBD att avslöja muskel membranskada är en stödjande parameter upprättandet likheter i djurmodell för att den mänskliga sjukdomstillståndet ^9. Kraften i EBD i mus har lett flera laboratorier, inklusive vår egen, att utveckla och tillämpa EBD till zebrafisk modeller av neuromuskulär sjukdom. På grund av tillämpligheten av EBD analys är denna teknik aktivt genomförs för att bekräfta zebrafisk modeller till den mänskliga sjukdomstillståndet ^{11,15,22,24,32.} Larver med skadade muskelmembran har EBD upptag och därför röd fluorescens inom muskelfibrer. Fluorescens observerades i inter-fiber utrymme, men inte inom de enskilda muskelfibrer kan också vara informativ fibrer lossnar från basalmembranet i than avsaknad av membranskada, ger användbar diagnostisk detalj. EBD-analys har potential ansökan bortom djurmodell validering. Insatser från vårt labb har nyligen visat att EBD analys är fördelaktigt att validera potentiellt nya terapeutiska läkemedel ^24. Avgöra om potentiella terapeutiska behandlingar minska eller avskaffa EBD upptag i neuromuskulära sjukdomsmodeller kan betyda relevant terapeutiska verkan ^8. Denna typ av analys kan hjälpa till att etablera den mekanism (er) av terapeutika och expanderar tillämpningen av EBD analys.

I likhet med många tekniker, inte EBD analys har flera förbehåll som skall iakttas vid experimentell design och praktik. Till exempel kan det vara svårt att identifiera CCV grund av förtjockningen av vävnaden med åldern. Dessutom är det lätt att skada larver som förberedelse före och under perikardiell injektionen, minska experimentella räknas och ökar behovet att prep stort antal larver.Dessutom kan fysiska skador på larver under hantering och injektion resultera i falska positiva som skadade muskler kan ta upp EBD. För att övervinna några av dessa hinder, har vi beskrivit en co-injektion strategi i denna video artikeln som gör det lätt och tillförlitlig identifiering av larver med framgångsrika färg infusion omedelbart efter injektionen och före efterföljande analys. FITC-dextran co-injektion kontroller för lyckad injektion genom att tillåta en bekräftelse på EBD i kärlsystemet före dess upptag av muskelfibrerna. Detta kan vara särskilt användbart när EBD fluorescens blir mycket diffusa larver efter flera timmar om det inte samlats in i muskelfibrerna; som sådan, kan det vara svårt att upptäcka. Dessutom saknas CCV och injicera EBD i gulan eller kroppskaviteten kan, efter inkubation, leda till diffus röd fluorescens liknande kontrollera embryon, men med minskad sannolikhet för upptag av skadade muskelfibrer. Kollektivt dessa grottaats föreslår EBD injektion kräver tålamod och praxis för att uppnå konsekventa och tillförlitliga resultat.

I alla, beskriver vi en praktisk och enkel metod för att utföra EBD analys på zebrafisk larver. Hittills har användningen av zebrafisk som ett modellsystem, särskilt som en mänsklig sjukdomsmodell, har snabbt växande. Denna expansion är delvis på grund av den fortsatta utvecklingen och ändrade experimentella tekniker som förbättrar på de nuvarande fördelarna med zebrafisk systemet. EBD injektionsteknik ger en extra och kraftfullt verktyg för en forskare arsenal för validering och studier av zebrafisk modeller muskelsjukdom. Den pågående genomförandet och modifiering av denna teknik har potential att bidra till att avslöja nya terapeutiska strategier samt sjukdoms orsakar mekanismer.

Materials

Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000	Sigma	FD10S
Evan's Blue Dye	Sigma	E2129
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma	A5040
100 mm Petri dish	Fischerbrand	FB0875712	Injection mold base
Thin wall glass capillaries	World Precision Instruments	TW100F-4	For Injection needle
Agarose	Bioshop	AGA001	Injection mold
Microinjection mold	Adaptive Science Tools	TU-1	Injection mold
Sodium chloride	Bioshop	SOD001	Ringer's solution
Potassium chloride	Bioshop	POC888	Ringer's solution
Magnessium chloride hexahydrate	Sigma	M2670	Ringer's solution
Sodium phosphate monobasic monohydrate	Sigma	S9638	Ringer's solution
HEPES	Sigma	H4034	Ringer's solution
Glucose	BioBasic	GB0219	Ringer's solution
Calcium chloride	Sigma	C1061	Ringer's solution