In this study, we describe a straightforward method to perform Evans Blue Dye (EBD) analysis on zebrafish larvae. This technique is a powerful tool for the characterization of skeletal muscle integrity and delineation of zebrafish models of muscular dystrophy, and is a valuable method for the development of novel therapeutics.
The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders. In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle membrane is a critical disease determinant. To date, numerous neuromuscular conditions display degenerating muscle fibers with abnormal membrane integrity; this is most commonly observed in muscular dystrophies. Evans Blue Dye (EBD) is a vital, cell permeable dye that is rapidly taken into degenerating, damaged, or apoptotic cells; in contrast, it is not taken up by cells with an intact membrane. EBD injection is commonly employed to ascertain muscle integrity in mouse models of neuromuscular diseases. However, such EBD experiments require muscle dissection and/or sectioning prior to analysis. In contrast, EBD uptake in zebrafish is visualized in live, intact preparations. Here, we demonstrate a simple and straightforward methodology for performing EBD injections and analysis in live zebrafish. In addition, we demonstrate a co-injection strategy to increase efficacy of EBD analysis. Overall, this video article provides an outline to perform EBD injection and characterization in zebrafish models of neuromuscular disease.
Muscular dystrophies constitute a group of prevalent and heterogeneous human muscle diseases with specific histopathological features1,2. Symptoms typically associated with this devastating group of diseases include muscle weakness, muscle degeneration, loss of motility, and early mortality1,3. The primary pathomechanisms of muscular dystrophies are the loss of proteins that stabilize the sarcolemma, anchor transmembrane complexes, and mediate cell signaling across the membrane4-6. For example, complete loss of the protein dystrophin, a primary scaffold protein of the dystrophin-glycoprotein complex, results in destabilization of the muscle membrane in Duchenne muscular dystrophy7. Due to the fact that most muscular dystrophies result from mutations in proteins that participate in the link between the extracellular matrix and the sarcolemmal cytoskeleton, a common observation at the cellular level is the loss of sacrolemmal integrity8,9. This understanding of the primary pathomechanism(s) associated with muscular dystrophies is the product of numerous years of research employing animal model systems2,10-15. However, despite advances in the field, there are still limited therapeutic options for treatment or management of the range of dystrophy subtypes. This limitation of viable therapies is due to several key factors: 1) the difficulty of gene therapy strategies, 2) a high frequency of de-novo disease cases and the corresponding lack of translatable animal models, and 3) the lack of rigorous strategies to test the physiological consequences of putative therapeutic agents with clear and reproducible outcome measures.
To overcome some of these limitations, numerous labs including our own are employing zebrafish as a system to model and study human neuromuscular diseases2. To date, zebrafish have proven a valuable tool in disease research. The zebrafish model has been used to identify and validate novel human disease causing mutations16,17, elucidate uncharacterized disease causing mechanisms17,18, and identify novel therapeutic strategies12,19. These advances were made, in part, by the canonical strengths of the zebrafish system such as their optical clarity, ease of genetic manipulation, and ability to breed in large numbers20. Zebrafish have additionally proven amendable to large-scale drug screens21, a valuable method for the identification of novel therapeutics22-24. Regarding muscle disease research, these strengths are complemented by the ability to isolate single zebrafish skeletal muscle fibers via dissociation25 and by the ability to examine myofiber organization in vivo using the optical phenomenon called birefringence26, which collectively allows for rapid determination of macroscopic muscle integrity. Regardless of these available utilities, further tool development is continuously required to advance investigation.
We, and others, have adapted a protocol for EBD injection and analysis in the zebrafish model. EBD is a vital, cell permeable dye that is taken up by damaged, degenerating, or apoptotic cells and then visualized under fluorescence27. To date, EBD analysis has extensively been used to analyze muscle membrane integrity in mouse models of skeletal muscle and heart diseases8,9,27. However, in mammalian preparations, harvested muscle typically requires laborious sectioning or dissection prior to analysis. In zebrafish, direct analysis is possible in high numbers using live and intact animals. In this video article, we will demonstrate the methodology to perform EBD injection and analysis in live zebrafish larvae, with representative images of EBD uptake in the zebrafish dystrophy mutant line sapje15,28. Furthermore, we present a co-injection strategy that allows for increased quantification of EBD preparations.
Zebrafisk växer fram som ett kraftfullt verktyg för att studera neuromuskulär sjukdom 2,29. Hittills har zebrafisk systemet använts för att validera nya muskel sjukdomsalstrande mutationer 16,17,30, belysa nya pathomechanisms 18, och identifiera potentiella nya terapeutiska läkemedel 12,24. Dessa kollektiva ansträngningar har etablerat nyttan av zebrafisk att modellera mänskliga neuromuskulära sjukdomar. Trots de framsteg som gjorts med zebrafisk och däggdjurs modeller, det finns begränsade behandlingsalternativ för patienter inom brett spektrum av neuromuskulära förhållanden. Därför finns en stor efterfrågan för terapi utveckling för denna grupp av förödande sjukdomar. Parallellt denna efterfrågan på läkemedel är motsvarande behovet av pågående experimentella innovation, samt en noggrann analys för att verifiera nya djurmodeller och förmodade terapeutiska strategier.
EBD-analys används ofta i musmodeller förstudie vävnad och cellskador i hjärnan, hjärtat och skelettmuskulaturen 27,31. Framför allt är EBD används flitigt i musmodeller av olika muskeldystrofi subtyper att visa allvaret i muskelmembran instabilitet och skada 8. Användningen av EBD att avslöja muskel membranskada är en stödjande parameter upprättandet likheter i djurmodell för att den mänskliga sjukdomstillståndet 9. Kraften i EBD i mus har lett flera laboratorier, inklusive vår egen, att utveckla och tillämpa EBD till zebrafisk modeller av neuromuskulär sjukdom. På grund av tillämpligheten av EBD analys är denna teknik aktivt genomförs för att bekräfta zebrafisk modeller till den mänskliga sjukdomstillståndet 11,15,22,24,32. Larver med skadade muskelmembran har EBD upptag och därför röd fluorescens inom muskelfibrer. Fluorescens observerades i inter-fiber utrymme, men inte inom de enskilda muskelfibrer kan också vara informativ fibrer lossnar från basalmembranet i than avsaknad av membranskada, ger användbar diagnostisk detalj. EBD-analys har potential ansökan bortom djurmodell validering. Insatser från vårt labb har nyligen visat att EBD analys är fördelaktigt att validera potentiellt nya terapeutiska läkemedel 24. Avgöra om potentiella terapeutiska behandlingar minska eller avskaffa EBD upptag i neuromuskulära sjukdomsmodeller kan betyda relevant terapeutiska verkan 8. Denna typ av analys kan hjälpa till att etablera den mekanism (er) av terapeutika och expanderar tillämpningen av EBD analys.
I likhet med många tekniker, inte EBD analys har flera förbehåll som skall iakttas vid experimentell design och praktik. Till exempel kan det vara svårt att identifiera CCV grund av förtjockningen av vävnaden med åldern. Dessutom är det lätt att skada larver som förberedelse före och under perikardiell injektionen, minska experimentella räknas och ökar behovet att prep stort antal larver.Dessutom kan fysiska skador på larver under hantering och injektion resultera i falska positiva som skadade muskler kan ta upp EBD. För att övervinna några av dessa hinder, har vi beskrivit en co-injektion strategi i denna video artikeln som gör det lätt och tillförlitlig identifiering av larver med framgångsrika färg infusion omedelbart efter injektionen och före efterföljande analys. FITC-dextran co-injektion kontroller för lyckad injektion genom att tillåta en bekräftelse på EBD i kärlsystemet före dess upptag av muskelfibrerna. Detta kan vara särskilt användbart när EBD fluorescens blir mycket diffusa larver efter flera timmar om det inte samlats in i muskelfibrerna; som sådan, kan det vara svårt att upptäcka. Dessutom saknas CCV och injicera EBD i gulan eller kroppskaviteten kan, efter inkubation, leda till diffus röd fluorescens liknande kontrollera embryon, men med minskad sannolikhet för upptag av skadade muskelfibrer. Kollektivt dessa grottaats föreslår EBD injektion kräver tålamod och praxis för att uppnå konsekventa och tillförlitliga resultat.
I alla, beskriver vi en praktisk och enkel metod för att utföra EBD analys på zebrafisk larver. Hittills har användningen av zebrafisk som ett modellsystem, särskilt som en mänsklig sjukdomsmodell, har snabbt växande. Denna expansion är delvis på grund av den fortsatta utvecklingen och ändrade experimentella tekniker som förbättrar på de nuvarande fördelarna med zebrafisk systemet. EBD injektionsteknik ger en extra och kraftfullt verktyg för en forskare arsenal för validering och studier av zebrafisk modeller muskelsjukdom. Den pågående genomförandet och modifiering av denna teknik har potential att bidra till att avslöja nya terapeutiska strategier samt sjukdoms orsakar mekanismer.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Trent Waugh för hans tekniskt bistånd. Vi erkänner också avdelningen av Pediatrics på sjukhuset för sjuka barn och Cure medfödd muskeldystrofi (CMD) för deras generösa stöd för detta projekt.
Fluorescein isothiocyanate-dextran MW 10,000 | Sigma | FD10S | |
Evan's Blue Dye | Sigma | E2129 | |
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma | A5040 | |
100 mm Petri dish | Fischerbrand | FB0875712 | Injection mold base |
Thin wall glass capillaries | World Precision Instruments | TW100F-4 | For Injection needle |
Agarose | Bioshop | AGA001 | Injection mold |
Microinjection mold | Adaptive Science Tools | TU-1 | Injection mold |
Sodium chloride | Bioshop | SOD001 | Ringer's solution |
Potassium chloride | Bioshop | POC888 | Ringer's solution |
Magnessium chloride hexahydrate | Sigma | M2670 | Ringer's solution |
Sodium phosphate monobasic monohydrate | Sigma | S9638 | Ringer's solution |
HEPES | Sigma | H4034 | Ringer's solution |
Glucose | BioBasic | GB0219 | Ringer's solution |
Calcium chloride | Sigma | C1061 | Ringer's solution |