Meten tarieven herbicide Metabolisme in Dicot Onkruid met een weggesneden Leaf Assay

Summary

This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.

Abstract

In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.

Introduction

Herbicideresistentie in onkruid vormt een ernstige bedreiging voor de wereldwijde productie van voedsel en vezels ^1,2. Momenteel duizenden van resistente bevolking en biotypen van meer dan honderd wiet soorten wereldwijd zijn gedocumenteerd en onderzocht ^3. Een belangrijk mechanisme dat herbicide resistentie in planten is de verandering van herbicide doel- ter genen en eiwitten, met inbegrip van genetische mutaties die herbicide-eiwit binding kinetiek of amplificatie van het target-gen ter ² beïnvloeden. Metabole ontgifting via de verhoogde activiteiten van cytochroom P450 monooxygenase (P450) of glutathion S-transferase (GST) enzymen is een ander mechanisme dat herbicideresistentie in onkruid, dat verschilt op verschillende manieren van target-locatie-gebaseerde mechanismen ² verleent. -Metabolische gebaseerde verzet heeft belangrijke gevolgen voor de vraag of planten fitness kosten (aka fitness sancties) kan het gevolg zijn van het herbicide-resistentie mechanism, alsmede over de mogelijkheden voor een enkele detoxificatie mechanisme om cross- of meerdere herbicideresistentie in onkruidpopulaties ^1,2,4 verlenen. In het algemeen, kunnen herbicide metabolisme in planten worden onderverdeeld in drie fasen ^5. Fase I omvat herbicide conversie of activering zoals P450-gemedieerde hydroxylering van aromatische ringen of alkylgroepen of door N – of O- dealkylering reacties, wat leidt tot verhoogde polariteit en gedeeltelijke herbicide ontgifting ^5,6. Nieuw geïntroduceerde functionele groepen in Fase I koppeling plaatsen voor conjugatie kunnen bieden aan gereduceerd glutathion met GST of glucose door UDP-afhankelijke glycosyltransferases in Fase II ^5,7. Bijvoorbeeld, grote initiële metaboliet van primisulfuron-methyl in maïs hydroxy-primisulfuron-methyl ^8, die verder kan worden omgezet in hydroxyl-primisulfuron-glucoside (fase II) en vervolgens getransporteerd naar de vacuole voor langdurige opslag of verdere metabolische proverwerking ^5,6 (Fase III).

Waterhemp (Amaranthus tuberculatus) is moeilijk te control, tweezaadlobbige jaarlijkse onkruidsoorten die de productie van maïs (Zea mays), sojaboon (Glycine max), en katoen (Gossypium hirsutum) in de Verenigde Staten belemmert. De hoge mate van genetische diversiteit van waterhemp wordt vergemakkelijkt door zijn tweehuizig biologie en lange afstand wind bestuiving, en een vrouwelijke waterhemp plant kan produceren tot een miljoen zaden ^9. Deze zaden zijn klein en gemakkelijk verspreid, wat natuurlijk begiftigen waterhemp een effectieve verspreiding mechanisme. Waterhemp toont continu kieming gedurende het groeiseizoen ^9, en de zaden kunnen ontkiemen na enkele jaren van kiemrust. Waterhemp is een C ₄ plant die een hoger groeipercentage dan de meeste breedbladige onkruiden in akkerbouw teeltsystemen ¹⁰ bezit. Daarnaast waren er talrijke waterhemp populatie resistent zijn tegen meerdere famIlies herbiciden ^3.

Een populatie van waterhemp (aangeduid MCR) vanaf Illinois is tegen 4-hydroxy-fenylpyruvaat dioxygenase (HPPD) -inhibiting herbiciden ^11, zoals mesotrione, alsmede atrazine en acetolactaatsynthase (ALS) -inhibiting herbiciden, waaronder primisulfuron-methyl , als gevolg van niet-target-site op basis mechanismen ^12,13. Een andere populatie waterhemp aangewezen ACR ^14, die primisulfuron-methyl-bestand (als gevolg van een mutatie in het ALS-gen) en atrazine-resistent maar gevoelig voor mesotrione en een waterhemp populatie aangewezen WCS ¹⁴ die gevoelig is voor primisulfuron-methyl, mesotrione en atrazine werden vergeleken met MCR in ons eerder onderzoek ¹² en actuele experimenten (samengevat in tabel 1). Eerste studies niet veranderingen in de HPPD gensequentie of expressie niveaus, of verminderde opname mesotrione detecteren, in de MCRpopulatie vergelijking met mesotrione-gevoelige populaties ^12. Echter, het metabolisme studies met hele planten aangetoond aanzienlijk lagere niveaus van de ouder mesotrion herbicide in MCR vergelijking met ACR en WCS, die gecorreleerd zijn met eerdere fenotypische reacties op Mesotrione ^11,12.

Waterhemp Bevolking	Afkorting	Fenotype Mesotrione	Mesotrione resistentiemechanisme	Fenotype primisulfuron	Primisulfuron resistentiemechanisme
McLean County-Resistant	MCR	Resistente	Metabolisme *	Resistente	Metabolisme
Adams County-Resistant	ACR	SENSITive	–	Resistente	Target-website mutatie in ALS 14
Wayne County-Sensitive	WCS	Gevoelig	–	Gevoelig	–

* Niet-target-terrein resistentie mechanismen, anders dan verbeterde stofwisseling, kan ook verlenen mesotrione weerstand in de MCR bevolking ^12.

Tabel 1: beschrijving waterhemp populaties van Illinois in deze studie.

Naast het bepalen van de tarieven van herbicide metabolisme in intacte waterhemp zaailingen, werd een verschillende experimentele benadering ontwikkeld en toegepast in lopende onderzoek metabolisme onderzoeken met behulp van een uitgesneden waterhemp bladassay ¹² en verschillende P450 remmers (bijv tetcyclacis en malathion). Deze methode is specifiek aangepast voor waterhemp een Previlende onderzoek primisulfuron-methyl metabolisme in weggesneden maïs laat ^15, omdat de weggesneden blad test nog niet gemeld voor het uitvoeren van herbicide metabolisme onderzoek in een tweezaadlobbige plant. De organophophosate insecticide malathion is vaak gebruikt voor in vivo en in vitro-metabolisme herbicide onderzoek P450 betrokkenheid ¹⁶ geven. Bijvoorbeeld, tolerantie en snelle metabolisme van mesotrione in maïs zijn te wijten aan P450-gekatalyseerde ring hydroxylering, die werd gecontroleerd toen malathion verhoogde gevoeligheid maïs mesotrione ^17. Ook malathion remde het metabolisme van de ALS-remmer primisulfuron-methyl in weggesneden maïs laat ^15. Een belangrijk voordeel van het uitgesneden blad techniek is dat gegevens die onafhankelijk zijn van gehele plant translocatie patronen, een belangrijke factor om te overwegen bij het beoordelen metabolisme van systemische herbiciden na het opkomen in planten. Derhalve maakt deze werkwijze kwantitatief enkwalitatieve metabole analyses te richten op één behandeld blad ^12.

Een vegetatieve kloneringsstrategie, in combinatie met het uitgesneden blad protocol, is eerder gebruikt in waterhemp tot metabolismeonderzoeken ¹² voeren. Vanwege de aard van uitkruising waterhemp (aparte mannelijke en vrouwelijke planten), en de grote mate van genetische diversiteit binnen tweehuizig Amaranthus soorten ^9, dit protocol ervoor gezorgd dat genetisch identieke waterhemp zaailingen werden geanalyseerd binnen het tijdsverloop experimenten. Dit artikel toont de bruikbaarheid van het uitgesneden blad werkwijze voor het meten van snelheden van herbicide metabolisme in een dicotyl onkruid (waterhemp). De resterende hoeveelheid bovenliggende herbicide werd bepaald op elk tijdstip (figuur 1) door niet-lineaire kleinste kwadraten regressie-analyse, en werd geschikt met een eenvoudige eerste orde curve voor de schatting van de tijd tot 50% van de geabsorbeerde herbicide te breken ( DT _50). Vertegenwoordigerchromatogrammen van omgekeerde fase hoge prestatie vloeistofchromatografie (RP-HPLC) worden getoond voor ALS-bestendige -gevoelige waterhemp populaties, waarbij de verdwijning van bovenliggende herbicide en gelijktijdige vorming van polaire metabolieten (s) geven gedurende een tijdsverloop studie (figuur 2). De focus van het artikel is het beschrijven en demonstreren van de bruikbaarheid van het uitgesneden blad assay in combinatie met een vegetatieve klonen werkwijze voor het bepalen nauwkeurige en reproduceerbare snelheden van herbicide metabolisme in dicotyle planten, met behulp gelijkmatig ring gemerkt (URL- ¹⁴ C) herbiciden waterhemp drie populaties die verschillen in hun hele plant reacties op HPPD- en ALS-remmende herbiciden (tabel 1).

Protocol

1. Plant Materiaal, Groei Voorwaarden en vegetatieve Klonen Opmerking: Drie waterhemp populaties werden onderzocht in dit onderzoek: MCR (van McLean Provincie, IL), ACR (van Adams County, IL) en WCS (van Wayne County, IL) (tabel 1). Verzamelen en schorten waterhemp zaden in 0,1 g L -1 agar: water oplossing bij 4 ° C gedurende ten minste 30 dagen kieming te verbeteren. Opmerking: Sommige waterhemp populaties slapende, maar deze stap helpt om kiemrust ov…

Representative Results

Grote verschillen in snelheden van mesotrione metabolisme gedetecteerd tussen een WCS en ACR en MCR (figuur 1). Op elk tijdstip was MCR mesotrione sneller dan de twee mesotrione gevoelige populaties, WCS en ACR, correleert met eerdere hele plant fenotypische respons 11 gemetaboliseerd. Door klonen genoeg planten uit een enkele ouderplant van elke populatie, herbicide metabolisme tijdsverloop analyses uniform en reproduceerbaar door het ontbreken van de genetische variatie binnen elke tijdsver…

Discussion

De uitgesneden blad hierin beschreven werkwijze is eerder gebruikt in onderzoeken primisulfuron metabolisme in maïs bladeren ^15, maar onze resultaten tonen aan dat dit protocol ook doeltreffend, nauwkeurig en reproduceerbaar te meten herbicide metabolisme in een tweezaadlobbige onkruidsoorten ^12. Een belangrijk voordeel van het uitgesneden blad techniek vergeleken met hele plant studies is dat een uitgesneden blad onafhankelijk is van de hele plant translocatie patronen postemergence, systemische …

Materials

Agar	Sigma-Aldrich	A1296	for pre-germinating seeds
Potting medium	Sun Gro Horticulture	49040233	for plant growth
Nutricote	Agrivert	TOTAL BLEND 13-13-13 T100	slow-release fertilizer
Growth chamber E15	Controlled Environments Limited	20207	plant culturing
Tris base	Fisher Scientific	BP152-500	buffer for excised leaves
HCl (concentrated)	Fisher Scientific	A144500	adjust pH of buffer
Murashige and Skoog (MS) salts	Sigma-Aldrich	M0404	incubation of excised leaves
Methanol	Fisher Scientific	A452-4	leaf washes after incubation
Acetone	Sigma-Aldrich	179124	plant extractions
Acetonitrile (HPLC grade)	Macron Fine Chemicals	MKH07610	HPLC mobile phase
Formic acid	Mallinckrodt Analytical	MK259205	acidify mobile phase pH
Micro-centrifuge	Eppendorf	5417R	1.5 or 2.0 mL tubes
Centrifuge (temperature controlled)	Eppendorf	5810R	15 or 50 mL tubes
Polypropylene centrifuge tube	Corning Inc.	430790	15 mL, sterile
Rotary evaporator	BÜCHI	R200	concentrate plant samples
Liquid scintillation spectrometry (LSS)	Packard Instruments	104470	quantify 14C
High-performance liquid chromatography	Perkin Elmer	N2910401	resolve herbicide metabolites
Flow scintillation analyzer	LabLogic System	1103303	for HPLC analysis of 14C
Hypersil Gold C18 column	Thermo-Scientific	03-050-522	reversed phase
Ultima-Flo M cocktail	Perkin Elmer	6013579	for Flow-scintillation analyzer
Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD)	Fisher Scientific	SX18	for LSS; biodegradable
Laboratory homogenizer	Kinematica	CH-6010	homogenize leaf samples