Измерение Курсы гербицида обмена веществ в двудольных сорняков с Пробирной вырезали Leaf
Summary
This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
Abstract
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Introduction
Устойчивости к гербицидам сорняков в представляет серьезную угрозу для мирового производства продовольствия и волокон 1,2. В настоящее время тысячи устойчивых популяций и биотипов из более чем ста видов сорняков во всем мире были задокументированы и изучены 3. Основным механизмом, который придает устойчивость к гербициду в растениях является изменение гербицидов генов и белков-мишеней, в том числе сайта генетических мутаций, которые влияют на гербицид-белка кинетики связывания или амплификацию гена-мишени сайте 2. Метаболический детоксикации с помощью повышенных деятельности цитохрома P450 P450 (монооксигеназы) или глутатион S -transferase (GST) ферментов является еще одним механизмом, который придает устойчивость к гербициду в сорняков, которая отличается несколькими способами от целевой сайт на основе механизмов 2. Метаболический основе сопротивления имеет значительные последствия для того, завод фитнес расходы (ака фитнес штрафов) может привести от mechanis гербицидам сопротивлениям, а также в отношении возможности для единого механизма детоксикации придания поперечного или нескольких гербицидам в сорняков населения 1,2,4. Как правило, к гербициду растений обмен веществ в можно разделить на три фазы 5. Этап I включает превращение гербицидам или активации такого как Р450 опосредованного гидроксилирования ароматических колец или алкильных групп, или путем N – O- или реакций деалкилирования, что приводит к увеличению полярности и частичное гербицида детоксикации 5,6. Недавно введены функциональные группы в фазе я могу предоставить сайтов сцепления для сопряжения с восстановленного глутатиона по GSTS или глюкозы UDP-зависимых гликозилтрансфераз в фазе II 5,7. Например, основная первоначальная метаболит примисульфурон-метил кукурузы представляет собой гидрокси-примисульфурон-метил 8, которые могут быть дополнительно метаболизируется гидрокси-примисульфурон-глюкозид (этап II), а затем транспортируется в вакуоль для длительного хранения или дальнейшей метаболических заботки 5,6 (Фаза III).
Waterhemp (амарант tuberculatus) является трудной к контролю, двудольные однолетние виды сорняков, что препятствует производство кукурузы (Zea Mays), соевое (Глицин макс), и хлопок (хлопчатник обыкновенный) в Соединенных Штатах. Высокая степень генетического разнообразия waterhemp способствует его двудомное биологии и междугородной ветра опыления, и один женский waterhemp завод может производить до миллиона семян 9. Эти семена мелкие и легко распространяться, что, естественно, наделить waterhemp эффективным механизмом разгона. Waterhemp отображает непрерывную прорастание всей вегетации 9, и его семена могут прорасти через несколько лет покоя. Waterhemp является С 4 растение, обладает более высокой скоростью роста, чем большинство широколиственных сорняков в сельскохозяйственных системах земледелия 10. Кроме того, многочисленные популяции waterhemp устойчивы к многократному семИлиеш гербицидов 3.
Популяция waterhemp (обозначенной MCR) из Иллинойс устойчив к 4-гидрокси-phenylpyruvate диоксигеназой (HPPD) -inhibiting гербициды 11, такие как мезотрионом, а также атразина и ацетолактатсинтазу (ALS) -inhibiting гербициды, в том числе примисульфурон-метил , из-за механизмов, основанных 12,13 нецелевых-сайта. Другой население waterhemp обозначены ACR 14, который примисульфурон-метил-стойкие (из-за мутации в гене АЛС) и атразина устойчивостью, но чувствительны к мезотрионом и населением waterhemp назначенного WCS 14, чувствительного к примисульфурон-метил, мезотрион и атразин были использованы в сравнении с MCR в нашем исследовании 12 предварительного и текущего экспериментов (приведены в таблице 1). Первоначальные исследования не обнаружили изменений в уровнях последовательность гена HPPD или выражение или уменьшается поглощение мезотриона, в MCRНаселение по сравнению с Мезотрион чувствительных популяций 12. Тем не менее, исследования метаболизма с целыми растениями показали, значительно более низкие уровни родительского мезотриона гербицида в MCR по сравнению с ACR и WCS, который коррелирует с предыдущих ответах фенотипических к Мезотрион 11,12.
| Waterhemp Население | Сокращение | Фенотип Мезотрион | Мезотрион Сопротивление Механизм | Фенотип примисульфурон | Примисульфурон Сопротивление Механизм |
| Маклин Каунти устойчивостью | MCR | Стойкий | Метаболизм * | Стойкий | Метаболизм |
| Адамс Каунти устойчивостью | ACR | SensitIve | – | Стойкий | Целевая-сайт мутация в ALS 14 |
| Уэйн Каунти-Чувствительный | WCS | Чувствительный | – | Чувствительный | – |
* Механизмы сопротивления Номера целевой сайт, чем другие расширения метаболизма, также может придавать устойчивость мезотриона в популяции MCR 12.
Таблица 1: Описание waterhemp населения от Иллинойса, используемых в данном исследовании.
В дополнение к определению ставки гербицидов метаболизма в интактных проростков waterhemp, другая экспериментальный подход был разработан и использован в нашем предыдущем исследовании, чтобы исследовать метаболизм с помощью вырезали waterhemp лист теста 12, а также различные ингибиторы P450 (например, tetcyclacis и Малатион). Этот метод был адаптирован специально для waterhemp из previПодразделения исследование примисульфурон-метил метаболизма в вырезанной кукурузы оставляет 15, так как Иссеченную лист анализ еще не поступало проведения гербицид метаболизм исследования в двудольных растений. Organophophosate инсектицид малатион был часто используется для ин виво и ин витро исследований гербицидам метаболизм указывают на вовлечение P450 16. Например, толерантность и быстрый метаболизм мезотрионом кукурузы обусловлены Р450-катализируемой кольцо гидроксилирования, которая была проверена при малатион повышенная чувствительность к кукурузы мезотрионом 17. Точно так же, малатион ингибирует метаболизм АЛС ингибитор примисульфурон-метил в вырезанной кукурузы оставляет 15. Основным преимуществом вырезанной техники является то, что лист данные, полученные не зависят от целого растительных узоров транслокации, важным фактором при оценке метаболизма системных гербицидов, послевсходовой в растениях. Следовательно, этот метод позволяет количественный иКачественный метаболический анализы сосредоточиться на одной обработанной листа 12.
Растительный стратегией клонирования, в сочетании с протоколом вырезанной листьев, ранее использовались в waterhemp проводить исследования метаболизма 12. Из-за скрещивания природы waterhemp (отдельный мужской и женских растений), и большой степенью генетического разнообразия внутри вида двудомных амаранта 9, этот протокол гарантировал, что генетически идентичные саженцы waterhemp были проанализированы в экспериментах времени курса. Эта статья демонстрирует полезность вырезали методом листьев для измерения скорости метаболизма гербицида в двудольных сорняков (waterhemp). Количество родительского гербицида остальные определяли в каждой временной точке (рис 1) с помощью нелинейной регрессии наименьших квадратов анализа, и согласуется с простой кривой первого порядка для того, чтобы оценить время для 50% поглощенной гербицида деградировать ( DT 50). Представительныйхроматограммы из обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ-ВЭЖХ) показаны на АЛС-стойкие и, чувствительными к популяции waterhemp, которые указывают на исчезновение головной гербицида и сопутствующим образованием метаболита полярной (ов) во время исследования блюд (рис 2). В центре внимания нашей статьи является описание и продемонстрировать полезность вырезанной листьев анализа в сочетании с растительным методом клонирования для определения точных и воспроизводимых ставки гербицидов метаболизма в двудольных растений, используя единообразно кольцо меченных (url- 14 С) гербициды в три популяции waterhemp, которые отличаются по их реакции целого растительных HPPD- и ALS-гербицидов, ингибирующих (Таблица 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Метод вырезали лист описано ранее использовался в исследовании примисульфурон метаболизм в листьях кукурузы 15, но наши результаты показывают, что этот протокол является также эффективным, точным и воспроизводимым для измерения гербицид обмен веществ в двудольных видов сорняко…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
- Yu, Q., Powles, S. Metabolism-based herbicide resistance and cross-resistance in crop weeds: A threat to herbicide sustainability and global crop production. Plant Physiology. 166, 1106-1118 (2014).
- Powles, S. B., Yu, Q. Evolution in action: plants resistant to herbicides. Annual Reviews in Plant Biology. 61, 317-347 (2010).
- Heap, I., et al. Global perspective of herbicide-resistant weeds. Pest Management Science. 70 (9), 1306-1315 (2014).
- Délye, C., et al. Non-target-site-based resistance should be the centre of attention for herbicide resistance research: Alopecurus myosuroides as an illustration. Weed Research. 51 (5), 433-437 (2011).
- Kreuz, K., Tommasini, R., Martinoia, E. Old enzymes for a new job. Herbicide detoxification in plants. Plant Physiology. 111, 349-353 (1996).
- Riechers, D. E., Kreuz, K., Zhang, Q. Detoxification without intoxication: herbicide safeners activate plant defense gene expression. Plant Physiology. 153, 3-13 (2010).
- Siminszky, B. Plant cytochrome P450-mediated herbicide metabolism. Phytochemistry Reviews. 5 (2-3), 445-458 (2006).
- Fonné-Pfister, R., et al. Hydroxylation of primisulfuron by an inducible cytochrome P450-dependent monooxygenase system from maize. Pesticide Biochemistry and Physiology. 37 (2), 165-173 (1990).
- Steckel, L. E. The dioecious Amaranthus spp.: here to stay. Weed Technology. 21 (2), 567-570 (2007).
- Horak, M. J., Loughin, T. M. Growth analysis of four Amaranthus species. Weed Science. 48 (3), 347-355 (2000).
- Hausman, N. E., et al. Resistance to HPPD-inhibiting herbicides in a population of waterhemp (Amaranthus tuberculatus) from Illinois, United States. Pest Management Science. 67 (3), 258-261 (2011).
- Ma, R., et al. Distinct detoxification mechanisms confer resistance to mesotrione and atrazine in a population of waterhemp. Plant Physiology. 163, 363-377 (2013).
- Guo, J., et al. Non-target-site resistance to ALS inhibitors in waterhemp (Amaranthus tuberculatus). Weed Science. in press, (2015).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. A waterhemp (Amaranthus tuberculatus) biotype with multiple resistance across three herbicide sites of action. Weed Science. 53 (1), 30-36 (2005).
- Kreuz, K., Fonné-Pfister, R. Herbicide-insecticide interaction in maize: malathion inhibits cytochrome P450-dependent primisulfuron metabolism. Pesticide Biochemistry and Physiology. 43 (3), 232-240 (1992).
- Correia, M. A., Ortiz de Montellano, P. R., Ortiz de Montellano, P. R. . Cytochrome P450: Structure, Mechanism, and Biochemistry. , 247-322 (2005).
- Hawkes, T. R., et al. Mesotrione: mechanism of herbicidal activity and selectivity in corn. Proceedings of the Brighton Crop Protection Conference – Weeds. 2, 563-568 (2001).
- Patzoldt, W. L., Tranel, P. J., Hager, A. G. Variable herbicide responses among Illinois waterhemp (Amaranthus rudis and A. tuberculatus) populations. Crop Protection. 21 (9), 707-712 (2002).
- Jalaludin, A., Yu, Q., Powles, S. B. Multiple resistance across glufosinate, glyphosate, paraquat and ACCase-inhibiting herbicides in an Eleusine indica population. Weed Research. 55 (1), 82-89 (2015).
- Iwakami, S., et al. Cytochrome P450 CYP81A12 and CYP81A21 are associated with resistance to two acetolactate synthase inhibitors in Echinochloa phyllopogon. Plant Physiology. 165, 618-629 (2014).
