एक excised पत्ता परख के साथ dicot मातम में शाक चयापचय की दर को मापने
Summary
This manuscript describes how herbicide metabolism rates can be effectively quantified with excised leaves from a dicot weed, thereby reducing variability and removing any possible confounding effects of herbicide uptake or translocation typically observed in whole-plant assays.
Abstract
In order to isolate and accurately determine rates of herbicide metabolism in an obligate-outcrossing dicot weed, waterhemp (Amaranthus tuberculatus), we developed an excised leaf assay combined with a vegetative cloning strategy to normalize herbicide uptake and remove translocation as contributing factors in herbicide-resistant (R) and –sensitive (S) waterhemp populations. Biokinetic analyses of organic pesticides in plants typically include the determination of uptake, translocation (delivery to the target site), metabolic fate, and interactions with the target site. Herbicide metabolism is an important parameter to measure in herbicide-resistant weeds and herbicide-tolerant crops, and is typically accomplished with whole-plant tests using radiolabeled herbicides. However, one difficulty with interpreting biokinetic parameters derived from whole-plant methods is that translocation is often affected by rates of herbicide metabolism, since polar metabolites are usually not mobile within the plant following herbicide detoxification reactions. Advantages of the protocol described in this manuscript include reproducible, accurate, and rapid determination of herbicide degradation rates in R and S populations, a substantial decrease in the amount of radiolabeled herbicide consumed, a large reduction in radiolabeled plant materials requiring further handling and disposal, and the ability to perform radiolabeled herbicide experiments in the lab or growth chamber instead of a greenhouse. As herbicide resistance continues to develop and spread in dicot weed populations worldwide, the excised leaf assay method developed and described herein will provide an invaluable technique for investigating non-target site-based resistance due to enhanced rates of herbicide metabolism and detoxification.
Introduction
मातम में शाक प्रतिरोध भोजन और फाइबर 1,2 के वैश्विक उत्पादन के लिए एक गंभीर खतरा प्रस्तुत करता है। वर्तमान में, एक सौ से अधिक खरपतवार प्रजातियों से प्रतिरोधी आबादी और biotypes की दुनिया भर में हजारों दस्तावेज और 3 अध्ययन किया गया है। पौधों में शाक प्रतिरोध प्रदान कि एक प्रमुख तंत्र शाक-प्रोटीन बाध्यकारी कैनेटीक्स या लक्ष्य-साइट जीन 2 के प्रवर्धन को प्रभावित करने वाले आनुवंशिक परिवर्तन सहित शाक लक्ष्य-साइट जीन और प्रोटीन की परिवर्तन है। साइटोक्रोम P450 monooxygenase (P450) या glutathione एस -transferase (जीएसटी) एंजाइमों का ऊंचा गतिविधियों के माध्यम से मेटाबोलिक विषहरण लक्ष्य-साइट-आधारित तंत्र 2 से कई मायनों में अलग है जो मातम में शाक प्रतिरोध, प्रदान कि एक और तंत्र है। मेटाबोलिक-आधारित प्रतिरोध (फिटनेस दंड उर्फ) संयंत्र रखरखाव लागत शाक-प्रतिरोध mechanis से हो सकता है कि क्या के लिए महत्वपूर्ण असर हैमीटर, साथ ही खरपतवार आबादी 1,2,4 में पार या एकाधिक-शाक प्रतिरोध प्रदान करने के लिए एक एकल विषहरण तंत्र के लिए क्षमता के बारे में। आम तौर पर, पौधों में शाक चयापचय तीन अलग चरणों 5 में विभाजित किया जा सकता है। बढ़ी हुई polarity और आंशिक शाक विषहरण 5,6 करने के लिए अग्रणी, या हे dealkylation प्रतिक्रियाओं – चरण मैं इस तरह के खुशबूदार छल्ले या एल्काइल समूहों के पी 450 की मध्यस्थता hydroxylation, या एन द्वारा के रूप में शाक रूपांतरण या सक्रियण शामिल है। नवनियुक्त मैं GSTs द्वारा कम glutathione करने के विकार के लिए लिंकेज साइटों प्रदान कर सकते हैं या द्वितीय चरण 5,7 में यूडीपी-निर्भर glycosyltransferases द्वारा ग्लूकोज के लिए पहले चरण में कार्य समूहों की शुरुआत की। उदाहरण के लिए, मक्का में primisulfuron मिथाइल के प्रमुख प्रारंभिक मेटाबोलाइट आगे हाइड्रोक्सी primisulfuron-glucoside करने के लिए (द्वितीय चरण) metabolized और फिर लंबी अवधि के भंडारण या आगे चयापचय के लिए रिक्तिका के लिए ले जाया जा सकता है, जो हाइड्रोक्सी primisulfuron मिथाइल 8, है समर्थकcessing 5,6 (तीसरे चरण)।
Waterhemp (चौलाई tuberculatus) संयुक्त राज्य अमेरिका में मक्का का उत्पादन (Zea mays), सोयाबीन (ग्लाइसिन मैक्स), और कपास (Gossypium hirsutum) hinders कि एक मुश्किल-नियंत्रण, dicot वार्षिक खरपतवार प्रजाति है। waterhemp की आनुवंशिक विविधता के उच्च स्तर के अपने डायोसिअस जीव विज्ञान और लंबी दूरी की हवा परागण से मदद की है, और एक भी महिला waterhemp संयंत्र एक लाख बीज 9 तक का उत्पादन कर सकते हैं। इन बीजों को स्वाभाविक रूप से एक प्रभावी प्रसार तंत्र के साथ waterhemp प्रदान करना है, जो छोटे और आसानी से फैल रहे हैं। Waterhemp बढ़ती मौसम 9 के दौरान निरंतर अंकुरण को प्रदर्शित करता है, और उसके बीज निद्रा के कई वर्षों के बाद अंकुरित करने के लिए सक्षम हैं। Waterhemp कृषि योग्य फसल प्रणाली 10 में सबसे चौड़े मातम की तुलना में उच्च विकास दर के पास है कि एक सी 4 संयंत्र है। इसके अलावा, कई waterhemp आबादी कई परिवार के लिए प्रतिरोधी रहेशाक 3 की ilies।
इलिनोइस से waterhemp (एमसीआर नामित) की आबादी 4-हाइड्रोक्सी phenylpyruvate dioxygenase (ह्प्प्द) ऐसे mesotrione रूप -inhibiting शाक 11, साथ ही atrazine और acetolactate सिन्थेज़ (ए एल एस) के लिए, शाक -inhibiting primisulfuron मिथाइल सहित के लिए प्रतिरोधी है , गैर लक्ष्य ठहरते आधारित तंत्र 12,13 के कारण। और atrazine प्रतिरोधी लेकिन mesotrione के प्रति संवेदनशील है, और primisulfuron मिथाइल के प्रति संवेदनशील है कि WCS 14 नामित एक waterhemp आबादी (कारण एक ए एल एस जीन में उत्परिवर्तन के लिए) primisulfuron मिथाइल-प्रतिरोधी है जो एसीआर 14 नामित waterhemp का एक अलग आबादी, mesotrione, और atrazine हमारे पूर्व अनुसंधान 12 और वर्तमान प्रयोगों में एमसीआर के साथ तुलना में इस्तेमाल किया गया (तालिका 1 में संक्षेप)। प्रारंभिक अध्ययन एमसीआर में, ह्प्प्द जीन अनुक्रम या अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन, या कम mesotrione तेज का पता नहीं चलाजनसंख्या जब mesotrione के प्रति संवेदनशील आबादी 12 के साथ तुलना में। हालांकि, पूरे पौधों के साथ चयापचय के अध्ययन 11,12 mesotrione करने के लिए पिछले प्ररूपी प्रतिक्रियाओं के साथ सहसंबद्ध जो एसीआर और WCS, के साथ तुलना में एमसीआर में माता-पिता mesotrione शाक की काफी निचले स्तर का प्रदर्शन किया।
| Waterhemp जनसंख्या | संक्षिप्त | Mesotrione को phenotype | Mesotrione प्रतिरोध तंत्र | Primisulfuron को phenotype | Primisulfuron प्रतिरोध तंत्र |
| मैकलीन काउंटी प्रतिरोधी | एमसीआर | प्रतिरोधी | चयापचय * | प्रतिरोधी | चयापचय |
| एडम्स काउंटी प्रतिरोधी | एसीआर | Sensitमैंने | – | प्रतिरोधी | ए एल एस 14 में लक्ष्य-साइट उत्परिवर्तन |
| वेन काउंटी के प्रति संवेदनशील | WCS | संवेदनशील | – | संवेदनशील | – |
* बढ़ाया चयापचय के अलावा अन्य गैर लक्ष्य-साइट प्रतिरोध तंत्र ने भी एमसीआर आबादी 12 में mesotrione प्रतिरोध प्रदान कर सकते हैं।
तालिका 1: इस अध्ययन में इस्तेमाल इलिनोइस से waterhemp आबादी का विवरण।
बरकरार waterhemp पौध में शाक चयापचय की दर का निर्धारण करने के अलावा, एक अलग प्रयोगात्मक दृष्टिकोण विकसित किया गया था और एक excised waterhemp पत्ती परख 12 के साथ ही विभिन्न P450 अवरोधकों (जैसे, tetcyclacis और मेलाथियान) का उपयोग करके चयापचय जांच करने के लिए हमारे पिछले अनुसंधान के क्षेत्र में कार्यरत हैं। इस पद्धति का एक previ से waterhemp के लिए विशेष रूप से अनुकूलित किया गया थाexcised पत्ती परख अभी तक एक dicot संयंत्र में शाक चयापचय अनुसंधान के संचालन के लिए सूचना नहीं किया गया था के बाद से excised मक्का में primisulfuron मिथाइल चयापचय के ous जांच, 15 को छोड़ देता है। organophophosate कीटनाशक मेलाथियान अक्सर इन विवो के लिए इस्तेमाल किया गया है और इन विट्रो शाक-चयापचय अनुसंधान में P450 भागीदारी 16 से संकेत मिलता है। उदाहरण के लिए, सहिष्णुता और मक्का में mesotrione का तेजी से चयापचय मेलाथियान mesotrione 17 को मक्का संवेदनशीलता में वृद्धि हुई जब सत्यापित किया गया था जो P450 उत्प्रेरित अंगूठी hydroxylation, के कारण हैं। इसी तरह, मेलाथियान excised मक्का में ए एल एस अवरोध करनेवाला primisulfuron मिथाइल 15 के पत्तों की चयापचय हिचकते। पौधों में प्रणालीगत, postemergence herbicides के चयापचय का आकलन करते समय excised पत्ती तकनीक का एक प्रमुख लाभ उत्पन्न डेटा पूरे संयंत्र translocation पैटर्न से सम्बंधित है, एक महत्वपूर्ण पहलू पर विचार करने के लिए। नतीजतन, इस विधि मात्रात्मक अनुमति देता है औरगुणात्मक चयापचय एक भी इलाज किया पत्ती 12 पर ध्यान केंद्रित करने का विश्लेषण करती है।
एक वनस्पति क्लोनिंग रणनीति, excised पत्ती प्रोटोकॉल के साथ संयोजन में, पहले से चयापचय के अध्ययन 12 का संचालन करने के waterhemp में उपयोग किया गया था। कारण waterhemp (अलग नर और मादा पौधों), और डायोसिअस चौलाई प्रजातियों 9 के भीतर आनुवंशिक विविधता की बड़ी डिग्री के outcrossing प्रकृति के कारण, इस प्रोटोकॉल आनुवंशिक रूप से समान waterhemp पौध समय पाठ्यक्रम प्रयोगों के भीतर का विश्लेषण किया गया है कि यह सुनिश्चित किया। यह लेख एक dicot निराना (waterhemp) में शाक चयापचय की दर को मापने के लिए excised पत्ती विधि की उपयोगिता को दर्शाता है। माता-पिता शाक की मात्रा (अवशोषित शाक का 50% नीचा करने के लिए समय का अनुमान लगाने के क्रम में एक साधारण पहली आदेश की अवस्था के साथ फिट किया गया था गैर रेखीय कम से कम वर्गों प्रतिगमन विश्लेषण द्वारा हर समय बिंदु (चित्रा 1) में निर्धारित किया गया था और शेष डीटी 50)। प्रतिनिधिउलट चरण उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (आरपी-एचपीएलसी) से chromatograms प्रतिरोधी ए एल एस-और एक समय पाठ्यक्रम के अध्ययन के दौरान माता-पिता शाक और ध्रुवीय मेटाबोलाइट (एस) के सहवर्ती गठन के लापता होने का संकेत मिलता है, जो संवेदनशील waterhemp आबादी, (चित्रा के लिए प्रदर्शित कर रहे हैं 2)। हमारे लेख के ध्यान में समान रूप से अंगूठी लेबल (URL- 14 सी) herbicides का उपयोग कर, का वर्णन है और dicot पौधों में शाक चयापचय की सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य दरों के निर्धारण के लिए एक वनस्पति क्लोनिंग विधि के साथ संयोजन में excised पत्ती परख की उपयोगिता का प्रदर्शन करने के लिए है उनके पूरे संयंत्र प्रतिक्रियाओं में मतभेद है कि तीन waterhemp आबादी HPPD- और करने के लिए ए एल एस-बाधा शाक (1 टेबल)।
Protocol
Representative Results
Discussion
यहाँ बताया excised की पत्ती विधि मक्का 15 के पत्तों में primisulfuron चयापचय शोध में पहले से इस्तेमाल किया गया है, लेकिन हमारे परिणाम इस प्रोटोकॉल भी एक dicot खरपतवार प्रजातियों 12 में शाक चयापचय को मापने के लिए, प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Wendy Zhang, Austin Tom, Jacquie Janney, Erin Lemley, and Brittany Janney for assistance with plant growth and extractions, Dr. Anatoli Lygin for assistance with chromatographic analyses, and Syngenta Crop Protection for funding.
Materials
| Agar | Sigma-Aldrich | A1296 | for pre-germinating seeds |
| Potting medium | Sun Gro Horticulture | 49040233 | for plant growth |
| Nutricote | Agrivert | TOTAL BLEND 13-13-13 T100 | slow-release fertilizer |
| Growth chamber E15 | Controlled Environments Limited | 20207 | plant culturing |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | buffer for excised leaves |
| HCl (concentrated) | Fisher Scientific | A144500 | adjust pH of buffer |
| Murashige and Skoog (MS) salts | Sigma-Aldrich | M0404 | incubation of excised leaves |
| Methanol | Fisher Scientific | A452-4 | leaf washes after incubation |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | plant extractions |
| Acetonitrile (HPLC grade) | Macron Fine Chemicals | MKH07610 | HPLC mobile phase |
| Formic acid | Mallinckrodt Analytical | MK259205 | acidify mobile phase pH |
| Micro-centrifuge | Eppendorf | 5417R | 1.5 or 2.0 mL tubes |
| Centrifuge (temperature controlled) | Eppendorf | 5810R | 15 or 50 mL tubes |
| Polypropylene centrifuge tube | Corning Inc. | 430790 | 15 mL, sterile |
| Rotary evaporator | BÜCHI | R200 | concentrate plant samples |
| Liquid scintillation spectrometry (LSS) | Packard Instruments | 104470 | quantify 14C |
| High-performance liquid chromatography | Perkin Elmer | N2910401 | resolve herbicide metabolites |
| Flow scintillation analyzer | LabLogic System | 1103303 | for HPLC analysis of 14C |
| Hypersil Gold C18 column | Thermo-Scientific | 03-050-522 | reversed phase |
| Ultima-Flo M cocktail | Perkin Elmer | 6013579 | for Flow-scintillation analyzer |
| Scintillation Cocktail (ScintiVerse BD) | Fisher Scientific | SX18 | for LSS; biodegradable |
| Laboratory homogenizer | Kinematica | CH-6010 | homogenize leaf samples |
References
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