Von Konstrukten Crystals - Auf dem Weg zu Strukturbestimmung von β-Fass-Außenmembranproteine

Summary

β-barrel outer membrane proteins (OMPs) serve many functions within the outer membranes of Gram-negative bacteria, mitochondria, and chloroplasts. Here, we hope to alleviate a known bottleneck in structural studies by presenting protocols for the production of β-barrel OMPs in sufficient quantities for structure determination by X-ray crystallography or NMR spectroscopy.

Abstract

Membrane proteins serve important functions in cells such as nutrient transport, motility, signaling, survival and virulence, yet constitute only ~1% percent of known structures. There are two types of membrane proteins, α-helical and β-barrel. While α-helical membrane proteins can be found in nearly all cellular membranes, β-barrel membrane proteins can only be found in the outer membranes of mitochondria, chloroplasts, and Gram-negative bacteria. One common bottleneck in structural studies of membrane proteins in general is getting enough pure sample for analysis. In hopes of assisting those interested in solving the structure of their favorite β-barrel outer membrane protein (OMP), general protocols are presented for the production of target β-barrel OMPs at levels useful for structure determination by either X-ray crystallography and/or NMR spectroscopy. Here, we outline construct design for both native expression and for expression into inclusion bodies, purification using an affinity tag, and crystallization using detergent screening, bicelle, and lipidic cubic phase techniques. These protocols have been tested and found to work for most OMPs from Gram-negative bacteria; however, there are some targets, particularly for mitochondria and chloroplasts that may require other methods for expression and purification. As such, the methods here should be applicable for most projects that involve OMPs from Gram-negative bacteria, yet the expression levels and amount of purified sample will vary depending on the target OMP.

Introduction

β-barrel OMPs kann nur in den äußeren Membranen von Mitochondrien, Chloroplasten und Gram-negative Bakterien ^1-3 gefunden werden. Während sie ähnliche Rollen wie α-helicalen Proteinen dienen, sie haben eine sehr unterschiedliche Falte, bestehend aus einem zentralen Membran eingebetteten Domäne β-Fass im Bereich 8-26 antiparallelen β-Strängen mit jeder Strang eng mit den beiden benachbarten Stränge verbunden sind, (Figuren 1 und 2). Die ersten und letzten Stränge der β-Faß Domäne dann miteinander, fast ausschließlich in einer antiparallelen Art und Weise (mit Ausnahme der mitochondrialen VDAC) interagieren die β-Fass-Domäne von der umgebenden Membran zu schließen und abzudichten. Alle β-barrel OMPs haben extrazellulären Schleifen unterschiedlicher Sequenz und Länge, die eine wichtige Rolle bei der Liganden-Wechselwirkungen und / oder Protein-Protein-Kontakte spielen, wobei diese Schleifen manchmal so groß wie 75-Reste sind, wie in Neisseria-Transferrin-Bindungs ​​pro gefundentein A (TbpA) ^4. β-Fass OMP kann auch N-terminalen oder C-terminalen periplasmatischen Erweiterungen haben , die als zusätzliche Domänen für das Protein die funktionalen Zweck dienen (zB BamA ^5-7, FimD ^8,9, FadL ^10). Während viele Arten von β-Barrel OMP ¹¹ existieren, sind zwei der häufigsten Arten werden im Folgenden als Beispiele für diejenigen , die weniger vertraut mit dem Gebiet beschrieben, (1) TonB-abhängige Transporter und (2) Autotransporter.

TonB-abhängige Transporter (zB FepA, TbpA, BTub, Cir, etc.) sind von wesentlicher Bedeutung für die Nährstoff Import und enthalten eine N-terminale Domäne Stecker bestehend aus ~ 150 Reste , die in einem C-terminalen versteckt gefunden wird 22 Strang – β- Fass – Domäne in die äußere Membran ¹² (Figur 3) eingebettet ist . Während dieses Plug-Domäne Substrat verhindert, frei durch die Fass-Domäne vorbei, induziert Substratbindung innerhalb der Plug-Domäne eine Konformationsänderung thbei Zuleitungen Bildung (entweder durch Steck Umlagerung oder durch teilweise / vollständige Ausstoßen des Stopfens) zu Pore, die dann Substrattransport durch die äußere Membran in das Periplasma erleichtern kann. TonB-abhängige Transporter sind besonders wichtig für das Überleben einiger pathogener Stämme von Gram-negativen Bakterien, wie Neisseria meningitidis , die spezialisierte Transport entwickelt haben , die Nährstoffe wie Eisen fallen direkt von menschlichen Wirtsproteine ^{​​4,13,14.}

Autotransporter gehören der Typ V-Sekretionssystem von Gram-negativen Bakterien und sind ß-barrel OMPs, die aus einem β-Fass-Domäne bestehen (in der Regel 12-Stränge wie bei ESTA und ESPP) und einem Passagierdomäne, die entweder sezerniert oder an die vorgestellte Oberfläche der Zelle ^15,16 (Abbildung 3). Diese β-barrel OMPs dienen oft eine wichtige Rolle in der Zellüberlebens und der Virulenz der Passagierdomäne dient entweder als eine Protease, Adhäsin, und / oder andere effector dass vermittelt Pathogenese.

Konstruktionsverfahren, wie Röntgenkristallographie, NMR-Spektroskopie und Elektronenmikroskopie (EM) ermöglichen es uns, Modelle für die OMPs mit atomarer Auflösung zu bestimmen, welche wiederum verwendet werden können, genau zu entschlüsseln, wie sie innerhalb der äußeren Membran funktionieren. Diese wertvollen Informationen kann dann gegebenenfalls für Arzneimittel und die Entwicklung von Impfstoffen verwendet werden. Beispielsweise Transferrin – Bindungsprotein A (TbpA) wird auf der Oberfläche von Neisseria gefunden und ist für die Pathogenese erforderlich , da er direkt menschliches Transferrin bindet und extrahiert dann und importiert die Eisen für ihre eigene Überleben. Ohne TbpA kann Neisseria nicht Eisen aus dem menschlichen Wirt binden und sind nicht pathogen gemacht. Nachdem die Kristallstruktur von Transferrin humanen an TbpA gebunden ⁴ gelöst wurde, wurde es viel deutlicher , wie die beiden Proteine ​​verbunden sind , welche Regionen von TbpA die Wechselwirkung vermittelt, welche Reste für die Eisenextraktion durch TbpA wichtig waren, undwie könnte man Therapeutika gegen Neisseria Targeting TbpA entwickeln. Daher ist die Bedeutung der β-Barrel OMPs in Gram-negativen Bakterien, die für das Überleben und die Pathogenese gegeben, sowie in Mitochondrien und Chloroplasten-Funktion, und die Notwendigkeit für zusätzliche strukturelle Informationen über diese einzigartige Klasse von Membranproteinen und den Systemen, in denen sie funktionieren , allgemeine Protokolle werden mit dem Gesamtziel der Expression und Reinigung Ziel OMP auf hohem Niveau für die Charakterisierung von strukturellen Methoden vorgestellt.

Protocol

1. Klonierung und Expression Hinweis: Um strukturelle Untersuchungen zu ermöglichen, ausreichende Mengen an hochgereinigtem Protein muss hergestellt werden, und das im Allgemeinen mit der Klonierung und Überexpression des Ziel β-Fass – Außenmembranprotein (OMP) in E. coli (Abbildung 4). Bis heute sind alle OMP Strukturen β-Barrel, einschließlich jener Strukturen für mitochondriale VDAC wurden von bakteriell exprimiertem Protein 11 abgeleitet. Hier al…

Representative Results

YiuR ist ein TonB abhängig Eisen Transporter, der ein mutmaßliches Impfstoff Ziel gegen Yersinia pestis ist. Es wurde ursprünglich identifiziert einen Microarray – Assay. Dabei sind die Schritte, die unternommen wurden , um die Struktur von YiuR Verwendung Röntgenkristallographie zu bestimmen , werden beschrieben (Abbildung 9). Zur Klonierung der DNA-Sequenz von YiuR (minus der N-terminalen Signalsequenz) wurde PCR aus genomischer DNA amplifiziert und subklo…

Discussion

β-Fass OMP dienen wesentliche Rollen in Gram-negativen Bakterien, Mitochondrien und Chloroplasten und sind wichtige Ziele für die Strukturanalyse, die eine Fülle von Informationen über die wesentlichen molekularen Mechanismen, die an den äußeren Membranen dieser jeweiligen Organellen bieten. Jedoch reicht Probe für die Strukturanalyse der Herstellung nicht immer einfach, und daher eine allgemeine Rohrleitung für die Erzeugung von ausreichenden Mengen von Ziel-β-barrel OMPs zur Strukturbestimmung dargestellt, er…

Materials

Crystallization Robot	TTP Labtech, Art Robbins	–	Any should work here, except for LCP crystallization
PCR thermocycler	Eppendorf, BioRad	–
Media Shaker	New Brunswick, Infors HT	–
UV-vis spectrometer	Eppendorf	–
SDS-PAGE apparatus	BioRad	1645050, 1658005
SDS-PAGE and native gels	BioRad, Life Technologies	4561084, EC6035BOX (BN1002BOX)
AkTA Prime	GE Healthcare	–
AkTA Purifier	GE Healthcare	–
Microcentrifuge	Eppendorf	–
Centrifuge (low-medium speed)	Beckman-Coulter	–
Ultracentrifuge (high speed)	Beckman-Coulter	–
SS34 rotor	Sorvall	–
Type 45 Ti rotor	Beckman-Coulter	–
Type 70 Ti rotor	Beckman-Coulter	–
Dounce homogenizer	Fisher Scientific	06 435C
Emulsiflex	Avestin	–
Dialysis tubing	Sigma	D9652
LCP tools	Hamilton, TTP Labtech	–
VDX 24 well plates	Hampton Research	HR3-172
Sandwich plates	Hampton Research, Molecular Dimensions	HR3-151, MD11-50 (MD11-53)
Grace Crystallization sheets	Grace Bio-Labs	875238
HiPrep S300 HR column	GE Healthcare	17-1167-01
Q-Sepharose column	GE Healthcare	17-0510-01
Crystallization screens	Hampton Research, Qiagen, Molecular Dimensions	–
Gas-tight syringe (100 mL)	Hamilton	????